紫果西番莲果皮中 多酚提取工艺的比较及优化

张 玲,马于然,李春海,*

(1.广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心,广东普通高校食品科学创新团队, 广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心,广东茂名 525000; 2.广东石油化工学院环境与生物工程学院,广东茂名 525000)

近年来人们对多酚的研究越来越深入,现代医学研究表明[1-3],多酚具有较强的抗氧化、抗老化、降血压、降低胆固醇、抗癌、抗骨质疏松等功效,能够有效预防和抑制某些疾病[4-6]。

西番莲(Passifloraedulis)俗称百香果、鸡蛋果,属西番莲科,原产于澳大利亚和巴西,现在广泛分布于热带和亚热带地区,我国广东、海南、福建、台湾等地区种植西番莲已有很长的历史了[7]。目前对于西番莲的使用主要是用于生产果汁,而果皮的利用比较少,这样既浪费资源也污染环境[8]。许多研究表明,西番莲果皮中的黄酮、多酚等物质具有抗氧化作用,可以起到抑制衰老、细胞退化的作用,具有防癌、抗菌消炎、改善血液循环、降低胆固醇等多种对人体有利的功效[9]。

赵玉红等[10]采用有机溶剂提取法、超声波辅助提取法和超声波-复合酶法对樟子松树皮中的松多酚进行提取,多酚得率分别为12.56、23.01、30.12 mg/g。王华斌等[11]采用酶法对石榴皮中的多酚进行提取,结果表明,酶法提取石榴皮中多酚的提取率比溶剂浸提法高出16.84%。段宙位等[12]采用酶辅助有机溶剂浸提法提取沉香叶多酚,探讨了酶种类对多酚得率的影响,结果表明,纤维素酶辅助乙醇法提取沉香叶多酚的效果最好。但目前关于利用西番莲果皮提取多酚相关研究报道较少。

本试验主要研究紫果西番莲果皮中多酚的提取方法,优化并比较了有机溶剂提取法和纤维素酶辅助提取法两种方法的最优工艺条件和提取效果,寻求一种更加合理、高效、经济的提取方法和提取工艺条件,为西番莲果皮的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜紫果西番莲 产自广东茂名;无水乙醇 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;没食子酸 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;纤维素酶(酶活力785 U/mg) 江苏锐阳生物科技有限公司;福林酚 分析纯,上海展云化工有限公司。

722G型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;LFP-800A型高速多功能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;DZF-6090型立式真空干燥箱 上海东麓仪器设备有限公司;JA3003型电子天平 上海宇恒平科学仪器有限公司;HH-6型数显恒温水浴锅 常州博远试验分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 西番莲果皮粉的制备 挑选新鲜无霉变无腐烂的紫果西番莲,取果皮,清洗后切成细条,于40 ℃下真空干燥后,用粉碎机将果皮粉碎,过60目筛,得果皮粉,备用。

1.2.2 没食子酸最大吸收波长的确定 吸取3 mL浓度为0.020 mg/mL的没食子酸标准溶液于10 mL显色管中,加入1 mL的福林酚试剂,混合,摇匀,1 min内加入3 mL 10%的碳酸钠溶液,加蒸馏水定容至10 mL,于暗处反应1 h,以1 mL蒸馏水相同条件处理,以此为参比。用可见分光光度计在700～900 nm波长内扫描测定最大吸收波长。

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1.2.3 没食子酸标准曲线的绘制 分别配制没食子酸标准溶液0、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL,按1.2.2中确定的最大吸收波长处测其吸光度。以没食子酸质量浓度(mg/mL)为横坐标,以其吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4 多酚的乙醇提取工艺研究 称取西番莲果皮粉1 g于250 mL三角瓶中,加入一定体积浓度的乙醇水溶液,在一定温度的恒温水浴锅中浸提一段时间后,抽滤,吸取1 mL滤液定容于10 mL的容量瓶中,采用福林酚法测定多酚并计算其多酚得率。

1.2.5 多酚得率的测定 多酚的测定采用福林酚法,参考田树革等[13]的研究,计算多酚得率(X,mg/g),公式如下。

式中:C为校准曲线总多酚浓度,mg/mL;V1为稀释倍数;V2为提取液体积,mL;M为果皮质量,g。

1.2.6 正交优化试验 在单因素预实验基础上,确定正交试验的因素和水平,采用L9(34)正交优化试验,研究乙醇体积分数、料液比、提取时间和浸提温度4个因素对多酚得率的影响,筛选出最优的提取工艺条件。

1.2.7 多酚的纤维素酶辅助提取工艺研究 称取西番莲果皮粉1 g于250 mL三角瓶中,加入一定量的磷酸盐缓冲溶液和纤维素酶粉,在一定pH、一定温度下水浴浸提一段时间,抽滤得滤液,测其多酚;将滤渣加入60%乙醇,在40 ℃水浴中浸提150 min,结束后抽滤,测定滤液多酚。将两次测定的多酚合并,计算酶法辅助提取多酚的得率。

1.2.8 单因素实验 分别考察纤维素酶量(0、10、15、20、25、30 mg/g),液料比(20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1 mL/g),pH(3、4、5、6、7),酶解时间(20、40、60、80、100、120 min),酶解温度(30、40、50、60、70 ℃)5个单因素对多酚得率的影响。得到滤渣后,将滤渣按照乙醇提取法正交优化条件进行提取。测定两次提取的多酚含量,合并计算多酚得率。研究某一单因素影响时,其他条件取固定值,分别为纤维素酶用量取20 mg/g,酶解温度40 ℃,pH5,提取时间60 min,液料比30 mL/g。

1.2.9 正交优化试验 由单因素试验结果显示,酶解pH的影响相对于其它几个因素的影响是最小的,因此在正交试验阶段剔除对酶解pH这个因素的优化。因此,选取纤维素酶的量、液料比、酶解温度、酶解时间4个对多酚得率影响比较大的单因素进行L9(34)正交优化试验,研究各个因素对多酚得率的影响,筛选出最优的提取工艺条件。正交优化试验因素水平如表1所示。

表1 乙醇提取正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of ethanol extraction orthogonal test

表2 纤维素酶辅助提取法正交试验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal extraction of cellulase

1.3 数据处理

以上实验每组均平行进行三次,取均值;采用SPSS Statistics V 19.0软件对正交实验结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 没食子酸最大吸收波长的确定

图1 没食子酸溶液吸光值波段扫描Fig.1 Spectral scanning of absorbance value of gallic acid solution

2.2 没食子酸标准曲线的制作

以没食子酸质量浓度(mg/mL)为横坐标,以其吸光值(A)为纵坐标绘制标准曲线,如图2所示,拟合回归方程为:y=12.457x+0.0086,R2=0.9981,说明吸光值与浓度线性关系良好。

图2 没食子酸标准曲线Fig.2 Standard curve of gallic acid

2.3 乙醇提取工艺

在单因素实试验的基础上,以多酚得率为指标,采用L9(34)进行正交试验,结果如表3所示。

表3 正交试验结果与极差分析Table 3 Orthogonal test results and range analysis of ethanol extraction

结合表3和表4,4个单因素对西番莲果皮中多酚得率的影响的主次顺序为B>A>D>C,即液料比>乙醇体积分数>浸提温度>提取时间,最优组合为A3B2C3D1。因为最优组合在上述9组试验中没有出现,需要进行验证试验。在乙醇体积分数为60%,液料比为30∶1 mL/g,提取时间为150 min,浸提温度为40 ℃的条件下提取西番莲果皮中的多酚,平行实验3次,结果多酚的得率为(11.648±0.118) mg/g。

表4 正交试验方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4 纤维素酶辅助提取工艺条件研究

2.4.1 单因素分析

2.4.1.1 纤维素酶的用量对多酚得率的影响 纤维素酶的用量对多酚得率的影响如图3所示。

图3 纤维素酶的量对多酚得率影响Fig.3 Effect of cellulase amount on polyphenol yield

由图3可知,两个提取阶段柱形图显示多酚的溶出主要在酶解阶段,乙醇浸提阶段的多酚得率相对较少,这是因为在前部分的浸提时间中西番莲果皮中的多酚大部分被浸出,还有小部分多酚没有完全浸提,在乙醇提取阶段被浸提出来。但从总体上看两个阶段的多酚得率趋势与总的趋势相一致,都是随着纤维素酶用量的增加,多酚得率呈先增大后减小最终趋于平稳的趋势。这是因为第1阶段纤维素酶的破壁效果和膜的渗透性随着酶用量的上升而上升,当酶的量达到饱和时,酶解反应比较完全,如果继续增加酶的量只会降低酶与底物的接触面积,酶解的作用反而被抑制[17]。第1阶段纤维素酶的破壁效果越充分对于第2阶段乙醇浸提也有一定促进作用。因此选择纤维素酶用量为20 mg/g比较适合。

2.4.1.2 液料比对多酚得率的影响 液料比对多酚得率的影响见图4。

图4 液料比对多酚得率的影响Fig.4 Effect of liquid to material ratio on polyphenol yield

由图4可知,酶解阶段的多酚得率与总多酚得率趋势相一致,呈先上升后缓慢下降的趋势,这是因为随着液料比的增加,底物与酶、底物与溶剂接触完全,多酚得率就呈上升的趋势,但当液料比大于35∶1 mL/g以后,继续增加液料比,纤维素酶的有效作用浓度被稀释,酶与底物的有效接触面积变小,酶解不充分,最终多酚得率下降。第2阶段即乙醇浸提阶段呈下降趋势是因为在第1阶段过低的液料比使得西番莲果皮粉与溶剂接触不完全[18],多酚不能很好地溶出,在第2阶段乙醇浸提的体积相同的条件下,第1阶段有较多的多酚没有被充分溶出在第2阶段就能比较完全地溶出。从总体上分析可知,选择酶解的液料比为35∶1 mL/g比较合适。

2.4.1.3 pH对多酚得率的影响 由图5可知pH对多酚得率的影响。

图5 pH对多酚得率的影响Fig.5 Effect of pH on polyphenol yield

由图5可知,在酶解阶段、乙醇提取阶段多酚得率与总多酚得率变化趋势比较一致,均先上升后下降,这说明纤维素酶在pH5左右的酶解条件下,酶的活性比较大,在此范围内能够发挥最大活力,破壁效果比较好,加快分解西番莲果皮中纤维素成分,从而加快了果皮细胞中多酚的溶出。当酶解pH过高或过低都会影响到纤维素酶的活性,使得在酶解阶段和乙醇浸提阶段的多酚得率都会受到影响,最终使得多酚得率减小[18]。因此选择酶解pH5的酶解条件比较合适。

2.4.1.4 酶解时间对多酚得率的影响 图6显示的是酶解时间对多酚得率的影响。

图6 酶解时间对多酚得率的影响Fig.6 Effect of time on polyphenol yield

由图6可知,酶解时间在60 min内多酚得率变化比较明显,呈明显上升趋势。当时间超过60 min后多酚得率比较稳定,有较小幅度的下降趋势。这是因为随着时间的延长,纤维素酶发挥作用比较充分,西番莲果皮中的纤维素类物质被分解,从而使更多的多酚类物质被溶出;当时间过短酶解不充分,多酚溶出较低;时间过长有少量的多酚容易被氧化而转化为其他物质,导致多酚含量有下降趋势[19]。因此选择酶解时间为60 min效果比较好。

2.4.1.5 酶解温度对多酚得率的影响 酶解温度对多酚得率的影响如图7所示。

图7 酶解温度对多酚得率的影响Fig.7 Effect of temperature on polyphenol yield

由图7可以看出,随着温度的升高,酶解阶段、乙醇浸提阶段多酚得率和总多酚得率都呈先增加后下降的趋势。酶解温度在40～60 ℃时多酚得率都比较高,可见纤维素酶在40～60 ℃时酶活性比较高,纤维素酶解充分,细胞破碎比较完全,多酚溶出完全。温度过高或过低,纤维素酶都会受到抑制[19]。同时,多酚是一种热敏感性物质,温度过高会导致多酚损失,因此,在酶解阶段60 ℃以上的条件下多酚得率有所下降[20]。从总多酚得率来看,选择50 ℃的酶解温度比较合适。

2.4.2 纤维素酶辅助提取法正交优化 以多酚得率为指标,采用L9(34)进行正交试验,结果如表5所示。

表5 正交试验结果与极差分析Table 5 Orthogonal test results and range analysis of ethanol extraction

结合表5和表6,4个单因素对西番莲果皮中多酚得率的影响的主次顺序为B>A>D>C,即液料比>纤维素酶的量>酶解时间>提取温度,最优组合为A3B2C1D2。因为最优组合在上述9组试验中没有出现,需要进行验证试验。在酶解阶段提取工艺条件为:纤维素酶用量为25 mg/g,液料比为35 mL/g,酶解温度40 ℃,酶解时间为60 min,乙醇提取阶段:乙醇体积分数60%、液料比30 mL/g、时间150 min、温度40 ℃条件下提取西番莲果皮中的多酚,平行实验3次,结果多酚的得率为(15.096±0.0948) mg/g。

表6 正交试验方差分析表Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment

3 结论

在乙醇体积分数为60%,液料比为30∶1 mL/g,提取时间为150 min,浸提温度为40 ℃的条件下提取西番莲果皮中的多酚,在此条件下,结果多酚的得率为(11.648±0.118) mg/g。纤维素酶辅助提取的最佳条件为纤维素酶用量为25 mg/g,液料比为35∶1 mL/g,酶解温度40 ℃,酶解时间为60 min,结果多酚的得率为(15.096±0.0948) mg/g。由乙醇提取法和纤维素酶辅助提取法的正交试验分析得出的最优提取条件,并通过验证实验,最优条件下酶解提取,再按照单独乙醇提取法的最优条件2次提取,多酚得率比单纯乙醇提取法的多酚得率约高了29.6%。实验证明,采用纤维素酶辅助提取能够有效提高多酚得率,这是由于纤维素酶能够分解植物细胞壁,而且西番莲果皮中还有较多的粗纤维,起到除杂的作用,使细胞内物质能够更好地被提取出来。