核桃根际溶磷菌的筛选

李诗娟，宋祖文，王 丽*，黄仲华，盛玉珍,金开铭,张 玲,徐 磊

(1四川省林业科学院，四川 成都 610081；2 喜德县林业局，四川 喜德 616750;3.四川林业宣传中心，四川 成都 610000)

随着现代农业技术的发展，农业生产面临着化肥长期使用，甚至过量使用，导致农产品品质下降、肥料利用率低、土壤板结和地下水污染等问题。因此，国内外都在积极寻求发展绿色农业，提倡生产安全、无公害绿色食品。绿色食品生产过程中，要求不用或尽量少用化学肥料。而微生物菌肥是利用微生物生命活动导致作物获得特定肥料效应的一种肥料，具有营养全面、肥效持久、可改善作物品质、提高肥料利用率、改良土壤结构等特点[1,2]。因此微生物肥料是实行绿色农业的重要技术保证。

微生物功能菌作为微生物肥料的核心部分，是微生物肥料生产的关键技术。溶磷菌是一种重要的土壤功能菌，主要为农作物的生长发育提供磷元素，植物细胞中细胞膜主要由脂类、蛋白质和糖类组成，其中脂类约为50%，而脂类的主要成分为磷脂和胆固醇，由此可见磷元素对细胞的生长和增殖起重要作用；磷还参与植物生命过程的光合作用，糖和淀粉的利用和能量的传递过程。磷肥还能促进植物苗期根系的生长，使植物提早成熟。植物在结果时，磷大量转移到籽粒中，使得籽粒饱满。农作物缺磷时生长缓慢、矮小瘦弱、直立、分枝少，叶小易脱落；色泽一般，呈暗绿或灰绿色，叶缘及叶柄常出现紫红色;根系发育不良，成熟延迟，产量和品质降低。我国有约75%的土壤缺磷，且土壤中95%以上的磷都难以被植物直接吸收[3]。从20世纪70年代我国开始大量使用磷肥，然而约70%的磷肥转化为Ca-P，Fe-P等难以被植物吸收利用的形态固定在土壤中[4,5]，溶磷菌可以将土壤中的固定态磷转化成有效磷，因此合理利用溶磷菌与开发微生物菌肥对提高作物产量、减少化肥使用、降低环境污染有巨大前景。

1 实验材料

土壤样品：取自四川广元市朝天区蒲家乡河坝场村核桃种植园的核桃根际土壤。

培养基：Pikovskava无机解磷培养基[6]：葡萄糖10.0 g、酵母膏0.4 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3(PO4)210 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃灭菌19 min。

菌株：对照菌株：荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens) Asl.0867由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供。

菌肥菌剂：从广州微元生物科技有限公司购买溶磷菌菌剂分离得到菌肥1溶磷菌，从成都盖尔盖司生物科技有限公司购买的菌肥中分离出一株溶磷菌：菌肥2溶磷菌。

实验仪器：生物安全柜，生化培养箱，高速梯度PCR仪，恒温培养箱，分光光度计等。

2 实验方法

(1)菌种筛选：以Pikovskava无机解磷培养基为选择培养基，采用平板分离和划线纯化，从土壤和菌肥菌剂中分离得到溶磷菌。

(2)溶磷菌活力测定：在100 mL三角瓶中加入30 mL Pikovskava无机解磷培养基，121 ℃灭菌19 min，无菌操作，每瓶接入待测菌种2 mL，并作一不接菌的空白对照，均于30 ℃，160 r·min-1摇床上振荡培养7 d 后，取上清液测有效磷。

(3)菌种鉴定：鉴于分离得到的较高效溶磷菌和菌肥溶磷菌均为细菌，采用16SrRNA/rDNA序列测序做分子鉴定，用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，细菌用16SrDNA扩增引物(正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR反应，PCR产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司纯化测序。将所获得的序列在国际核酸数据库(NCBI)中进行同源序列的搜索，比较供试菌株与已知菌种模式菌株相应序列的相似度，对其做出鉴定。

(4)溶磷条件优化试验。以Pikovskava无机解磷培养基为发酵培养基，对发酵温度和初始pH值进行优化，①确定适宜温度范围：将接种后的发酵液分别置于16 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃条件下，转速160 r·min-1发酵7 d，测发酵液有效磷含量；②确定适宜初始pH值的范围：分别配置pH值为5、6、7、8、9、10的Pikovskava无机解磷培养基，接种后置于30 ℃，转速160 r·min-1条件下发酵7 d，测发酵液有效磷含量。

(5)培养基配方优化试验。①适宜碳源选择：分别用乙酸铵、草酸铵、淀粉、甘露醇、蔗糖、麸皮、甘油代替原培养基中的葡萄糖，接种和发酵条件不变，测定其溶磷能力；②适宜氮源选择：分别用氯化铵0.405 g·L-1、草酸铵0.538 g·L-1、尿素0.227 g·L-1、蛋白胨0.884 g·L-1、硝酸铵0.364 g·L-1代替原培养基中的硫酸铵，发酵5 d，接种和其他发酵条件不变，测定其溶磷能力；③金属离子对发酵的影响：在Pikovskava解无机磷液体培养基中分别加入CuS04·5H20 6.250 g·L-1、ZnS04·7H20 7.175 g·L-1、Fe2(SO4)39.965 g·L-1、CaCl22.775 g·L-1、MnSO4·H2O 4.225 g·L-1、NiSO4·6H2O 6.571 g·L-1的不同液体培养基，使其中金属离子Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+、Mn2+、Ni2+浓度均为0.025 mol·L-1，调节各培养基的pH值为7.0，接种和发酵条件不变，测定其溶磷能力。

3 结果与分析

3.1 溶磷菌分离纯化及活性测定

利用Pikovskava无机解磷平板培养基，从不同的土壤样品中筛选纯化出9株溶磷微生物，其中6株细菌，编号分别为Rpx1、Rpx2、Rpx3、Rpx4、Rpx5、Rpx6；3株真菌，编号为Rpm7、Rpm8、Rpm9；通过液体发酵试验，测定它们的溶磷活力，结果见表1。

表1溶磷菌活力比较

注：磷校准曲线：c=1.9372*A+0.0036 R2=0.9999 A：700 nm处样品吸光度

结果表明：Rpx4菌株溶磷能力比较高，溶磷率达到5.23%；而对照菌株As1.0867溶磷率只有4.42%，菌肥1、2溶磷率分别为6.62%，2.35%。

3.2 溶磷菌菌种鉴定

分别以Rpx4和菌肥1,2溶磷菌的DNA为模板，用16S rDNA PCR引物做PCR扩增，扩增产物直接送到成都擎科纯化测序，利用NCBI中BLAST软件对测序结果进行同源性比对搜索。结果表明：Rpx4与Bacillussp.(基因登录号：KF482860.1) 的遗传性最近，同源性为99%；菌肥1溶磷菌与Bacillussp.(基因登录号：GQ169805.1)的遗传性最近，同源性为99%；菌肥2溶磷菌与Bacillussp.(基因登录号：KU986677.1)的遗传性最近，同源性为99%；由此可见3种溶磷菌都是芽孢菌属。

3.3 溶磷条件优化试验结果

图1 不同pH值对3种溶磷菌解磷能力的影响注：图1～5中，纵坐标均表示发酵后发酵液中含磷量，单位为mg·L-1

从图1可以看出随着pH值的不断升高，溶磷菌的溶磷能力不断下降，其中菌肥1、菌肥2溶磷菌下降特别明显，而Rpx4下降最慢，溶磷能力稳定性最好，其适宜pH值范围为5～9，最适pH值为6。从图2可以看出，3种溶磷菌均在16 ℃～40 ℃时，溶磷能力稳定变化不大，最适温度出现在25 ℃～35 ℃之间。

图2 不同温度对3种溶磷菌解磷能力的影响

3.4 培养基配方优化试验结果

碳源：从图3可以看出，Rpx4和菌肥2最佳碳源为草酸铵，菌肥1最佳碳源为甘露醇。对3种溶磷菌而言，草酸铵、蔗糖、甘油都是较好的碳源。氮源：从图4可以看出，菌肥1和菌肥2最佳氮源为氯化铵，Rpx4最佳氮源为草酸铵。对3种溶磷菌而言，氯化铵、草酸铵都是较好的氮源。金属离子：从图5可以看出，Fe3+、Mn2+对Rpx4溶磷有促进作用，Mn2+、 Zn2+对菌肥1溶磷菌影响不显著，Fe3+、Ca2+对菌肥2溶磷菌有促进作用，而Cu2+、Ni2+会抑制三种溶磷菌解磷。

图3 不同碳源对3种溶磷菌解磷能力的影响

图4 不同氮源对3种溶磷菌解磷能力的影响

图5 不同金属离子对3种溶磷菌解磷能力的影响

4 讨论与结论

本研究从核桃林地土壤中分离得到一株高效溶磷菌Rpx4，通过16S rDNA鉴定为芽孢杆菌，目前芽孢杆菌的溶磷效果报道比较多，而且芽孢杆菌抗逆性强、能长时间存储，是比较好的一种菌肥菌种。有关细菌溶磷条件优化多从碳源、氮源、pH值、温度等方面进行研究[7,8,9]，本研究通过摇瓶发酵发现不同温度、初始pH值、碳源、氮源和金属离子对Rpx4的溶磷能力有很大影响。其适宜初始pH值范围为5～9，适宜温度范围为16 ℃～40 ℃，适宜氮源有硫酸铵、氯化铵、草酸铵、蛋白胨，适宜碳源有草酸铵、蔗糖、甘油，高浓度Fe3+、Mn2+对其活力有一定的促进作用，而Cu2+、Ni2+、Zn2+会抑制其解磷。通过比较不同发酵液配方及发酵条件下，Rpx4与两种菌肥中的溶磷菌解磷能力得出，Rpx4明显优于肥料2溶磷菌，在温度16 ℃～40 ℃、初始pH值为5～9时，其溶磷能力低于肥料1溶磷菌，但其溶磷能力稳定性最好，且对蛋白胨、硝酸铵两种氮源的适应性也高于肥料1溶磷菌，该溶磷菌添加到菌肥中有一定的市场潜力。另外，有报道表明一些溶磷菌具有一定的促生效益，如提高种子的发芽率及发芽指数，增加植物干重、株高及对磷的吸收的累积量等[10,11]。本研究只进行了溶磷优化条件试验，要真正应用到微生物菌肥工业化生产中还需进一步完善促生效益试验和生产工艺研究。