低频电磁场模拟脑电节律仪对SD大鼠脑含水量及外周血IL－6和TNF－α的影响＊

郭红燕，张金涛，李乃义，王凤娇，刘胜松

低频电磁场模拟脑电节律仪，是笔者所在医院自主研制并获得国家专利（国家实用新型专利公开号：CN201320347）的仪器。此仪器采用低频电磁场辐射方式进行设计，通过模拟脑电节律的电磁场对脑进行刺激，是治疗神经、心理、精神疾病的新手段［1］，用于治疗军人心理应激反应效果显著［2］。 为进一步验证其应用安全性，该研究采用脑电节律仪干预正常SD大鼠后，观察其对脑水肿和外周血IL－6、TNF－α的表达的影响。

1 材料与方法

1．1 一般资料

1.1.1 实验动物及分组 购于北京维通利华实验动物技术公司的SD大鼠60只，雌雄各30只，健康清洁级，8 周龄，体重（230±20） g，控制动物房 12 h白黑交替，温度为（23±2）℃，适应性喂养1 W。先将正常SD大鼠随机分为四组，每组15只，实验组在每日固定时间进行干预，发射源固定于清醒态大鼠颅顶骨外约2 cm处，1次/d，每次0.5 h，分别为正常对照组（A组），每日置于相同的固定装置内不予以治疗；1 HZ 组 （B 组）；10 HZ 组（C 组）；20 HZ 组 （D组），每日均在固定时间干预，30 min/d，连续7 d。

1.1.2 实验试剂及设备 酶联免疫检测试剂盒（IL－6购于南京建成生物工程研究所、TNF－α购于依科赛生物科技有限公司）、低频电磁场模拟脑电节律仪（解放军第八十八医院）、台式冷冻高速离心机（德国 Eppendorf 5810R）、电恒温烤箱（江苏太仓市实验厂）、全自动酶标仪 （美国Biotek ELX800UV）、全自动洗板机 （美国 Biotek ELX50/6）、超纯水系统（英国 Elga Puelab Bioscien）、漩涡混匀仪（美国 SCI Vortex）、超低温冰箱（－80 ℃，丹麦 Heo－Holten 3410）、单通道精密移液器 （德国Eppendorf Research）。

1.2 方 法

1.2.1 标本采集 干预结束后进行标本采集，在室温25℃条件下，用10%水合氯醛0.4 ml/100 g行腹腔麻醉注射。麻醉成功后，大鼠仰卧固定四肢，在胸骨左侧心脏搏动最强点穿刺，用抗凝采血管抽血约5 ml，混匀后高速离心机3000转/min离心10 min后取上清液，分装于离心管内，冻存于－80℃冰箱留待批量指标检测，采血完成后快速从上颈椎处剪断颈髓，剪除颅骨小心剥离脑膜，从延髓开始分离轻轻取出整脑，称脑湿重。置于100℃烤箱烤24 h，称脑干重。

1.2.2 脑组织含水量测定 大鼠麻醉后迅速断头取脑。用滤纸吸除脑组织表面的水分，电子分析天平（精确至0.001 g）称取湿重（W），再将脑组织置于100℃的恒温干燥箱烘烤24 h称取其干重（D）。应用Elliot公式计算脑组织的含水量：脑组织含水量（%）（BWC）=（湿重－干重）/湿重×100%。

1.2.3 血清学ELISA指标检测 （1）室温解冻血清标本后备用。（2）自试剂盒中取出所需酶标板条，室温复温30 min，将剩余板条密封放回4℃冰箱保存。（3）标准品的配置：1、2、3、4、5 号 IL－6 标准品依次为 5 ng/L、10 ng/L、20 ng/L、40 ng/L、80 ng/L。1、2、3、4、5、6、7、8 号 TNF－α 标准品依次为 0 pg/ml、31.25 pg/ml、62.5 pg/ml、125 pg/ml、250 pg/ml、500 pg/ml、1000pg/mL、2000pg/mL。 （4）设置好样本孔、标准品孔和空白孔，做复孔。（5）加样：①空白孔不加样品、生物素标记的抗 IL－6（TNF－α）抗体、链霉亲和素－HRP，只加显色剂和终止液，其余各部操作相同；②标准品孔加标准品50μl、链霉亲和素－HRP50μl；③样本孔先加待测样本40μl，再加生物素标记的抗 IL－6（TNF－－α）抗体 10 μl、链霉亲和素－HRP50μl， 盖上封板膜，IL－6在 37℃恒温箱温育 60 min（TNF－α 室温 120 min）。 （6）配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释成20×应用液，备用。（7）洗涤：到时间后，弃去孔内液体，并用吸水纸吸干，入洗板机重复洗板5次，拍干。（8）显色：每孔显色剂A、B各 50 μl，混匀，37℃避光孵育 10 min。（9）终止：各孔加入终止液50μl，终止反应 （此时蓝色立转黄色）。（10）测定：以空白孔调零，终止反应10 min内

测定，450 nm波长通过酶标仪测定各孔的OD值。（11）实验结果计算：以酶标孔中标准品的吸光度值通过作图，绘制标准曲线（X轴为标准品浓度，Y轴为相应的吸光度值），并根据样品吸光度值在该曲线图上分别求得相应的大鼠血清学IL－6与TNF－α的浓度。

1.2.4 统计方法 应用SPSS 18.0统计分析软件处理数据。计量资料用均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析（F检验）。均数两两比较采用LSD法 （最小显著差异法），P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物一般情况分析 整个实验过程，无动物伤亡事件，精神饮食均正常，活动正常，大小便正常，实验组与正常对照组的大鼠体重均呈持续增长状态。

2.2 IL-6的ELISA检测结果 正常对照组在血清中含量较低；各实验组中含量表达无明显变化，与正常对照组比较（P=0.999），差异无统计学意义。见表1。

表1 大鼠外周血IL-6的表达（浓度）结果

2.3 TNF-α的ELISA检测结果 正常对照组在血清中含量较低；实验组中含量表达无明显变化，与对照组比较（P=0.935），差异无统计学意义。见表2。

表2 大鼠外周血TNF-α的表达（浓度）结果

2.4 干预后大鼠脑组织的干湿重变化 A组、B组、C组、D组大鼠脑组织含水量分别为77.45±0.009、77.58±0.008、77.54±0.009、77.65±0.009 （P＞0.05），组间比较差异无统计学意义。见表3。

表3 大鼠脑含水量的表达结果

3 讨论

脑电节律仪在治疗精神疾病方面具有一定的应用价值，其原理主要是：通过诱导使大脑的两半球进入一种同步的状态（brain sync），即脑波同步状态，并诱发人脑产生α、β、θ、δ频率的脑电波，这几种脑电波与人的精神状态有着至关重要的联系［1］。目前，通常采用的诱导方式主要是通过声光刺激与低频电脉冲刺激；与之不同，笔者研制的脑电节律同步调节仪主要采用了低频电磁场辐射方式，通过人工制造的脑电节律电磁场对人体脑部进行刺激诱导［2］。近年研究发现，经颅磁刺激可以改善慢性应激抑郁模型大鼠的抑郁行为及海马神经元的凋亡［3］，并对可促进脑梗死后空间学习记忆功能恢复［4］；笔者之前通过水迷宫数据的变化研究也发现，采用模拟脑电节律仪的低频电磁场对正常大鼠的认知功能无不良影响，可能有改善作用［5］。

近年研究表明脑组织的损伤与炎症反应相关［3，4］。IL－6、TNF－α为促炎症性细胞因子，主要调节免疫应答，参与免疫细胞发育、刺激造血、介导炎症反应及参与组织修复等。IL－6是具有促进生长和分化等调节功能的炎症细胞因子，主要生物学功能是作为细胞分化因子，促进各类免疫细胞和造血细胞的分化、增殖，并介导急性炎症反应。在机体生理或病理条件下都发挥重要作用，不仅作用于免疫系统，还广泛作用于神经［5］、内分泌和心血管等系统。脉络丛室管膜细胞、血管内皮细胞、星形细胞、小神经胶质细胞及神经元等中枢神经细胞在不同损伤或刺激下可产生IL－6。大量的资料表明，在正常情况下脑内IL－6仅有低水平表达，脑损伤后表达明显增加。在脑损伤的早期IL－6水平明显增高，对中枢神经系统炎症与脑水肿的发生发展、神经元的退变和丢失以及中枢神经系统的免疫方面起着重要作用，而晚期IL－6水平再次升高，促进了脑组织的再生和修复，并可诱导脑微血管内皮细胞增生和血管的形成［6］。目前研究表明IL－6的作用可能通过以下机制：IL－6 与其受体（IL－6Ra）结合后，识别信号转导成分gp130，三者共同形成生物活性的三元复合体，该复合体激活细胞内的多种激酶，导致蛋白磷酸化和基因表达，进而发挥生物学作用。脑损伤后，不同实验动物脑组织、脑脊液和血清中均可以检测到IL－6 和 IL－6 受体水平升高［7］。 IL－6 水平增高可以出现在中枢神经系统创伤及感染性病患中。在颅脑损伤早期神经胶质细胞可以产生IL－6等细胞因子，使神经系统及外周血中IL－6的含量显著增高［8］。

TNF－α是被激活的巨噬细胞分泌的一种前炎症细胞因子，是炎症反应重要的起始因子之一。TNF－α可在全身发挥作用，具有广泛而复杂的生物学活性，释放增加引起多核白细胞激活聚集并释放炎症介质，诱导缺血神经元坏死和凋亡。TNF－α细胞来源极为广泛，各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、表皮细胞、角质细胞、平滑肌细胞以及急性脑缺血后的小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元等均可分泌TNF－α。TNF－α作为致炎因子通过诱发和促进炎症、细胞毒性、凝血等多种凋亡途径加剧缺血损伤［9］。损伤后TNF－α快速升高，具有神经毒性作用，加速神经死亡。TNF－α还加重脑水肿，损伤血脑屏障，促进趋化因子的生成，诱导白细胞聚集，产生大量的有害物质。动物实验表明［10］，脑损伤发生后，血浆及脑组织 TNF－α、IL－6含量均出现变化。细胞因子 IL－1β，TNF－α，IL－6，IL－8 等通过炎症细胞的活化，使血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的通透性增加［11］。TNF－α早期主要通过对毛细血管的直接毒性作用，使毛细血管的通透性增加，开放BBB，导致脑水肿。

既往研究表明，经颅磁刺激能利用时变磁场产生感应电场，引起生物电流在组织中传导，使得神经纤维、神经元和肌肉去极化，用以改变皮质神经细胞的动作电位，影响脑内代谢和神经电活动［12，13］。经颅磁刺激治疗广泛性焦虑障碍的疗效显著［14］；赵琳等研究经颅磁刺激可以改善慢性应激抑郁模型大鼠的抑郁行为及海马神经元的凋亡［15］。张靖慧等研究发现经颅磁刺激对可促进脑梗死后空间学习记忆功能恢复，并可能通过增加患侧海马区IL－1βmRNA表达来实现［16］。而经颅磁刺激对正常大鼠周围血TNF－α、IL－6的影响鲜有报道。笔者所在医院自主研制的脑电节律仪其作用机制是：采用低频电磁场方式制造的脑电节律对脑部进行刺激，利用反馈原理起安眠、精神松弛等治疗效果，为治疗精神疾病及心理疾病提供了新手段，而且不存在药物依赖及不良作用。

该研究进一步通过干预正常大鼠，观察了该节律仪所采用低频电磁场对脑含水量及外周血白介素－6、TNF－α的影响。研究发现，与对照组比较，实验组在每日固定时间，1次/d，30 min/次，连续7 d进行低频电磁场辐射后，1 HZ组 （B组）；10 HZ组（C组）；20 HZ组（D组）大鼠脑组织含水量组间比较差异无统计学意义；正常对照组在血清中IL－6、TNF－α含量均较低；低频电磁场辐射1周后各实验组中含量表达无明显变化，组间差异无统计学意义，说明脑电节律仪对正常大鼠周围血清中的TNF－α、IL－6含量无明显影响，既没有破坏血脑屏障导致脑水肿，又未启动机体的炎症免疫反应，对大鼠具有安全性。该研究探讨了TNF－α、IL－6因子结合脑水肿反映其安全性，但是有关确切机制和临床还有待进一步验证。