TNF-α介导的NF-κB通路在沙尘导致大鼠慢性咽炎中的作用及射干对其影响

刘雨娟 王 莉 姚 兰 蔺兴遥

(河西学院医学院，甘肃 张掖 734000)

研究发现〔1〕，在扬沙发生当天人群以呼吸系统为主的自觉症状发生率明显升高，扬沙过后开始下降，这些症状包括咳嗽、胸闷气短、咽干咽痛、眼睛干涩等。甘肃河西地区是中国西北干旱区沙尘暴活动比较频繁的地区，杨振华等〔2〕研究显示河西地区(民勤)居民呼吸系统受沙尘影响最大，其中沙尘诱发的5种最常见疾病中咽喉炎的发生率占到了18.8%。《神农本草经》记载：射干味苦寒，具有清热解毒、利咽消痰等功效，为治疗喉痹咽痛之药物，主治咽喉疾患之方剂大多以射干为君药组方，其效颇佳。我们前期的临床研究也证实，以射干为君药的中药复方对河西地区沙尘引发咽炎的治疗有较好的疗效。目前有关河西地区沙尘引发慢性咽炎及射干治疗此类疾患的作用机制报道甚少，因此本实验拟初步探讨射干治疗沙尘颗粒物所致的慢性咽炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 健康成年SD大鼠，SPF级，雌雄各半，共60只，体重(200±20)g，由甘肃中医药大学科研实验中心提供。药物、主要试剂及仪器：射干水煎液，由甘肃中医药大学科研实验中心中药前处理室提供。依那西普由辉瑞制药有限公司提供；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1、IL-6、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、核转录因子(NF)-κB试剂盒由西安科昊生物工程有限责任公司提供。沙尘模拟实验平台由甘肃省人民医院、中科院寒旱所联合研制。酶联免疫分析仪(BIO-TEC，U.S.A)；紫外分光光度计(UV-2401PC，日本)。

1.2方法 大鼠随机分组后，空白对照组每天于沙尘模拟实验平台给予正常吹风，不吸入沙尘，实验开始后的第31天开始，每天以生理盐水灌胃1 ml/100 g；模型组每天于沙尘模拟实验平台造模2 h，风速8 m/s，共45 d；依那西普组和射干组同模型组，但依那西普组在造模开始后的第31、38、45天按剂量皮下注射依那西普3次；射干组于造模开始后的第31天开始，每天灌胃相应剂量的药物共15 d。最后一天给药后2 h，各组大鼠以戊巴比妥钠麻醉，股动脉采血，分离血清，测定TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB含量，检测方法均严格按照试剂盒说明操作。采血后剪取咽部组织约0.8～1.0 g 2份，一份采用分光光度法检测MDA、T-AOC含量；一份用于病理组织切片，组织取材后，迅速投入10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色。

1.3药物浓度的计算 沙尘颗粒物(直径≤10 μm，PM10)，浓度水平>167.5 μg/m3。射干水煎液，成人每日服用量按药典为0.13 g生药/kg，大鼠灌胃剂量按成人6倍计算为0.78 g/kg，临用前以蒸馏水配制成浓度为7.8%的溶液，冰箱保存备用。依那西普冻干粉剂，临床成人治疗剂量为0.36 mg/kg，每周1次，大鼠腹部皮下注射剂量按成人6倍计算为2.16 mg/kg。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1咽部组织形态结构的改变 空白对照组咽部组织结构清晰，黏膜上皮光滑，固有层可见散在淋巴组织和腺泡，黏膜下有少量小血管，肌层纤维排列规则；模型组咽部组织分界不清，固有层和黏膜下水肿，小血管增多、充血，大量炎性细胞浸润，少量深入肌层组织，肌纤维排列不规则；依那西普组和射干组黏膜上皮逐渐恢复平整，黏膜上残留少量黏液，黏膜和黏膜下可见少量炎性细胞浸润。见图1。

2.2沙尘对大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB及咽部组织T-AOC、MDA等的影响 与空白对照组相比，模型组中IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB及MDA含量均明显升高，T-AOC含量则明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1，表2。

2.3药物对大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB及咽部组织T-AOC、MDA等的影响 与模型组相比，依那西普组和射干组IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB及MDA含量均明显降低，T-AOC含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。而依那西普组与射干组相比，以上指标差异均无统计学意义。见表1，表2。

表1 各组血清IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB水平比较

与空白对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

表2 各组咽部组织MDA、T-AOC含量比较

图1 各组咽部组织形态结构改变(HE染色，×400)

3 讨 论

慢性咽炎为咽部黏膜、黏膜下及淋巴组织的慢性炎症，表现为黏膜慢性充血，血管周围淋巴细胞、白细胞浸润，黏膜及黏膜下结缔组织增生，腺体肥大，黏液分泌增多。炎症反应是由多细胞、多因子参与的非常复杂的反应，其中炎性细胞因子和炎症介质增多。TNF-α、IL-1、IL-6是由炎性细胞合成和释放的主要的促炎细胞因子，研究〔3〕表明TNF-α、IL-1、IL-6过量表达参与慢性炎症性疾病。除此之外，TNF-α、IL-1、IL-6作为细胞外刺激因子，又可激活NF-κB，进一步放大炎症反应〔3〕。沙尘中的PM2.5 具有产生活性氧自由基(ROS)的能力〔4〕，ROS能引发细胞膜脂质过氧化，MDA是脂质过氧化的终末产物，过多的脂质过氧化物可导致机体的T-AOC减弱。氧自由基是炎症反应的效应器，氧自由基的过度产生也能通过模式识别受体分子(PRRs)和非模式识别受体诱导炎症反应〔5〕。本实验结果显示，河西地区沙尘颗粒物引发慢性咽炎时，增高促炎因子的水平，上调NF-κB的表达，降低机体的抗氧化能力，与上述结论一致。射干提取物对炎症有明显的抑制作用，且有一定的解热作用〔6〕。吴泽芳等〔7〕的研究还显示，射干能明显抑制巴豆油所致的炎性渗出和增生，对醋酸所致腹腔毛细血管通透性的增高有明显的抑制作用。除此之外射干还具有较强的清除自由基的作用〔8〕，也能增强抗氧化酶〔超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶等〕的活性，从而减轻对机体的氧化应激反应损伤。本实验结果显示射干可明显降低河西地区沙尘颗粒物引发慢性咽炎时促炎因子的水平，也能增强机体的抗氧化能力，因此推测射干可能通过降低促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6及ROS的表达，增强机体的抗氧化能力，以抑制沙尘颗粒物所致的咽部组织的慢性炎症损伤反应。

TNF-α属于TNF家族，为多功能的细胞因子，可以激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)蛋白酶、Jun氨基末端激酶(JNK)和NF-κB三条信号通路，实现其细胞毒性、抗病毒、免疫调节和细胞凋亡等生物学功能。TNF受体存在两种类型：TNF-R1和TNF-R2，均属于Ⅰ型膜蛋白。TNF-R2的信号转导通路目前并不太清楚。TNF-α与TNF-R1结合后，通过一系列接头分子和信号分子的传导，最后激活NF-κB，活化的NF-κB进入核内诱导促炎因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、趋化因子(IL-8)等炎性基因及转化生长因子(TGF)-β基因的表达参与免疫与炎症反应，NF-κB是调节炎症反应的重要因子〔9〕。依那西普是TNF-α拮抗剂，通过抑制TNF-α与TNF-R1结合起到控制炎症的作用。本实验选用依那西普后，明显抑制沙尘颗粒物引发的慢性咽炎中NF-κB的表达水平，并降低TNF-α、IL-1、IL-6的表达，从而减轻咽部炎症的损伤，提示NF-κB的激活可能是沙尘诱导咽部炎症损伤的重要因素之一。在沙尘组中，随着NF-κB通路中的两个上游分子TNF-α、IL-1表达显著上调，NF-κB的表达也明显上调；而射干组中当TNF-α、IL-1、IL-6的表达明显下调，NF-κB的表达也明显下调。这些结果说明在沙尘诱导的慢性咽炎中，沙尘颗粒物可以激活NF-κB信号通路中的上游分子TNF-α、IL-1，并使信息继续传递到下游激活NF-κB，使炎症介质的表达增加，而射干可能通过抑制TNF-α、IL-1介导的NF-κB激活来抑制沙尘颗粒物对咽部组织的炎症损伤反应。