枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石形成的影响

刘 英 王志勇 杨德慧 刘晓伟 高旭红 徐 辉

(承德医学院附属医院泌尿外科，河北 承德 067000)

泌尿系结石复发率高，成因和机制尚不十分清楚，草酸钙结石是泌尿系结石的最常见成分，肾小管上皮细胞损伤可能为肾草酸钙结石形成的基础病变，在某些因素的作用下，肾小管上皮受到损伤，有利于结石成分附着，且变性坏死细胞调入肾小管管腔内有利于晶体的异相成核。枸橼酸是尿石症形成的抑制物质，升高尿中枸橼酸浓度对尿石症具有防治作用〔1〕。Tamm-Horsfall蛋白是一种大分子有机物，和尿石症的形成关系密切〔2〕。本文对枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石形成的影响进行研究，并观察其对肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达强度的影响，探讨枸橼酸钾防治肾草酸钙结石形成的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：清洁级、雄性、成年SD大鼠27只，体重190～240 g，购自北京隆安实验动物养殖中心，许可证号：SYXK(京)2014-0040。

主要药品和试剂：乙二醇、氯化铵(湖南汇虹试剂有限公司)，枸橼酸钾(上海化学试剂采购供应站)，羊抗兔ABC染色系统试剂盒、Tamm-Horsfall多克隆抗体(美国Sigma公司)等。

1.2实验方法

1.2.1分组 27只大鼠根据随机数字法随机分为枸橼酸钾组、肾结石组和对照组，每组9只。对照组大鼠喂普通饮用水，肾结石组喂0.5%氯化铵和0.5%乙二醇混合液致石剂，枸橼酸钾组喂上述致石剂的同时给予25%枸橼酸钾液(1 ml/100 g灌胃，1次/d)，肾结石组和对照组给予等量饮用水灌胃，共14 d。14 d后留取24 h尿液进行尿钙离子和尿草酸浓度测定。下肢静脉采血5 ml进行血生化指标检测，然后麻醉大鼠打开腹腔，暴露肾脏，取双侧肾脏进行HE染色和免疫组化染色检验。

1.2.224 h尿钙离子和尿草酸浓度测定 24 h尿钙离子浓度采用全自动生化仪测定；24 h尿草酸浓度采用铬酸钾氧化甲基红催化光度法测定。

1.2.3血生化指标测定 血肌酐、血尿酸、血尿素氮均采用全自动生化仪进行测定。

1.2.4草酸钙结晶分级评分及肾组织HE染色 光镜下观察肾小管草酸钙结晶情况并进行评分；将肾脏组织切片后进行常规HE染色，观察肾小管草酸钙结晶形成情况，并在光镜下对肾小管草酸钙结晶沉积进行分级：0级没有草酸钙结晶；Ⅰ级有细小结晶但不成堆；Ⅱ级草酸钙结晶变大成堆，但相互之间不连接；Ⅲ级草酸钙结晶之间相互连接；Ⅳ级草酸钙结晶广泛成堆，连接成片。

1.2.5肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达测定 采用免疫组化法测定大鼠肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达，以肾组织Tamm-Horsfall多克隆抗体为一抗，设立阴性对照组〔以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗〕，显微镜下观察肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达强度，其中淡黄色(轻度染色)为“+”，棕黄色(中度染色)为“”，棕褐色(深度染色)为“”。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件，正态分布多组均数比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD检验，肾内结晶评分采用非参数Mann-WhitneyU检验；三组肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达强度比较采用非参数Kruskal-Walls检验，组内两两比较采用非参数Mann-WhitneyU检验，Tamm-Horsfall蛋白表达等级与肾结石相关性采用kendall tau-b等级相关系数分析。

2 结 果

2.1三组大鼠24 h尿钙离子和尿草酸浓度比较 三组大鼠24 h尿钙离子和尿草酸浓度比较差异具有统计学意义(P<0.05)，其中枸橼酸钾组和肾结石组24 h尿钙离子和尿草酸浓度均高于对照组(P<0.05)，肾结石组24 h尿钙离子和尿草酸浓度高于枸橼酸钾组(P<0.05)。见表1。

表1 三组24 h尿钙离子和尿草酸浓度比较

与枸橼酸钾组比较：1)P<0.05；与肾结石组比较：2)P<0.05；下表同

2.2三组血生化指标比较 三组血肌酐、血尿酸、血尿素氮比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中肾结石组血肌酐、血尿酸、血尿素氮水平均高于枸橼酸钾组和对照组(P<0.05)，枸橼酸钾组血尿酸高于对照组(P<0.05)，枸橼酸钾组血肌酐和血尿素氮与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三组血生化指标比较

2.3三组大鼠肾草酸钙结石HE染色 对照组大鼠肾小管未见草酸钙结晶，肾小管结构正常；肾结石组大鼠多数肾小管内见草酸钙结晶，肾小管扩张；枸橼酸钾组部分肾小管内见草酸钙结晶，肾小管扩张，但均较肾结石组轻。

2.4枸橼酸钾组和对照组草酸钙结晶分级评分比较 对照组肾小管无草酸钙结晶形成，枸橼酸钾组草酸钙结晶分级得分(0.61±0.43)显著低于肾结石组(1.52±0.94，Z=15.253，P<0.05)。

2.5三组肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达强度比较 三组Tamm-Horsfall蛋白均在肾小管亨氏攀和远曲小管表达，三组之间Tamm-Horsfall蛋白表达强度比较差异具有统计学意义(P<0.05)，其中枸橼酸钾组平均秩次为14.11，肾结石组平均秩次5.89，对照组平均秩次为22.00，肾结石组Tamm-Horsfall蛋白表达强度低于枸橼酸钾组和对照组(P<0.05)，枸橼酸钾组Tamm-Horsfall蛋白表达强度显著高于肾结石组(P<0.05)。见表3。

表3 三组肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达强度比较(n,n=9)

2.6Tamm-Horsfall蛋白表达与肾结石形成的关系 Tamm-Horsfall蛋白表达等级与肾结石形成呈负相关(r=-0.827，P=0.000)。

3 讨 论

大鼠草酸钙结石模型的建立有多种方法，包括乙二醇法、草酸盐法、乙醇酸法、葡萄糖酸钙法等，这些方法均可增加尿中草酸盐浓度〔3～5〕，而草酸钙结石形成的最危险因素即为草酸盐，乙二醇为草酸前体，重复性好，形成结石稳定，且价格低廉。本文表明乙二醇能够成功建立大鼠草酸钙结石模型。

枸橼酸盐是结晶抑制剂和络合剂，能够增加尿液pH值，是尿液碱化剂，使尿酸溶解度增加，促进尿结石排除，对于泌尿系统酸性结石的治疗效果更佳，是常用的泌尿系统结石治疗药物〔6,7〕。本研究结果发现，枸橼酸钾对肾草酸钙结石的形成有抑制作用。高草酸尿和高钙尿是草酸钙结石的主要诱发因素，高钙尿可以造成草酸钙过饱和形成泌尿系结石；高草酸尿对肾细胞有毒性作用，当肾上皮细胞在草酸中暴露时，肾上皮细胞的活性受到影响，草酸还可引起细胞线粒体功能变化，从而引起上皮细胞坏死和凋亡，促进结晶黏附，并促进结晶的核化和生长〔8〕。本研究结果发现：枸橼酸钾能够降低尿中钙离子和尿草酸浓度，考虑枸橼酸和尿中的钙离子结合形成枸橼酸钙，降低尿中钙离子浓度和草酸钙饱和度，从而抑制了草酸钙结晶的形成。

肾脏具有多种功能，血肌酐、血尿酸、血尿素氮是反映肾脏功能的重要指标，肌酐为肌酸的终末产物，肌酸量和肌肉量关系密切，两者呈正比，正常情况下，肌酐的产生速度比较稳定，并释放入血；尿素为蛋白质的代谢产物，肾脏为尿素的主要排泄器官。当肾脏受到损害时，血清肌酐、尿酸、尿素氮水平升高〔9～11〕。本研究结果发现，肾草酸钙结石大鼠的肾脏功能明显受到损害，而枸橼酸钾灌胃可以降低血肌酐、血尿酸、血尿素氮水平，有利于肾脏功能的恢复。

Tamm-Horsfall蛋白是泌尿系统结石形成的重要抑制因子，是尿液中含量最多的蛋白质之一，和泌尿系结石的形成关系密切〔12,13〕。本研究结果发现，正常大鼠肾组织中Tamm-Horsfall蛋白表达等级比较高，肾结石组大鼠肾组织Tamm-Horsfall蛋白表达等级比较低，枸橼酸钾可以升高肾草酸钙结石大鼠肾组织中Tamm-Horsfall蛋白表达等级。Tamm-Horsfall蛋白在枸橼酸离子的作用下聚集倾向减弱，抑制结晶聚集、生长、成核作用增强。Tamm-Horsfall蛋白表达等级越高，肾草酸钙结石的形成越少；Tamm-Horsfall蛋白表达等级越低，肾草酸钙结石形成越多。因此，考虑枸橼酸钾抑制肾草酸钙结石形成的机制可能和枸橼酸钾能够增加Tamm-Horsfall蛋白表达量有关。