心脑舒通及其单体成分对小鼠脑微血管内皮细胞缺氧复氧炎症损伤的影响

袁 庆 柴丽娟 王少峡 郭 虹 赵 莼 徐杨杨 马萌萌 王乔悦 胡利民

(天津中医药大学 天津市中药药理学重点实验室 省部共建方剂学教育部重点实验室，天津 300193)

Theanti-inflammatoryeffectofXinnaoshutonginhypoxiaandreoxygenationmousebrainmicrovascularendothelialcells

YUANQing,CHAILi-Juan,WANGShao-Xia,etal.

TianjinKeyLaboratoryofChineseMedicinePharmacology,KeyLaboratoryofPharmacologyofTraditionalChineseMedicalFormulaeMinistryofEducation，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Xinnaoshutong and its monomer component on the inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-1β in cerebral ischemia and reperfusion mouse brain microvascular endothelial cells line bEnd.3.MethodsIschemia-reperfusion inflammation injury bEnd.3 cells model was established, the effect of different concentrations Xinnaoshutong (0.1,1.0,10.0,50.0 μg/ml) or the monomer component(10μmol/ml) on cells vitality of bEnd.3 was detected. Inflammation-related factor TNF-α, IL-6, IL-1βlevel were measured by ELISA.ResultsXinnaoshutong significantly inhibited bEnd.3 cell cytoplasmic synthesis of TNF-α, while the supernatants of IL-6 secretion was inhibited but there was no statistical difference. The cytoplasmic synthesis or supernatants of IL-1β expression in bEnd.3 cells was not obvious.ConclusionsXinnaoshutong plays a therapeutic role in inflammatory injury of cerebral ischemia by inhibiting the synthesis inflammatory cytokines of TNF-α.

【Keywords】 Xinnaoshutong; Cerebral ischemia and reperfusion; Inflammatory cytokines; TNF-α; IL-6

脑缺血后的强烈炎症反应是造成脑组织继发性损伤的因素之一，在此炎症反应的过程中，有多种因素相互作用，共同引起了再灌注损伤，并且以其预后差，死亡率高而日益引起人们的关注〔1〕。 心脑舒通胶囊是由中药蒺藜属植物蒺藜干燥的地上全草提取物而制成的胶囊剂，以蒺藜总皂甙为其主要成分，具有活血化瘀、祛痰化湿、补益肝肾等功效〔2～4〕。现代药理学研究表明，其具有改善微循环，选择性增加脑缺血部位的供血及提高抗氧自由基等作用〔5〕。但其在脑缺血再灌注炎症损伤中发挥作用的研究较少。本实验旨在考察心脑舒通及其单体成分对缺氧复氧合并肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激损伤后bEnd.3(小鼠脑微血管内皮细胞)炎症相关因子TNF-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β释放的影响，初步探讨心脑舒通抗脑缺血再灌注炎症损伤的机制。

1 材料与方法

1.1材料 bEnd.3细胞株(ATCC，美国)，DMEM培养基(Corning，美国)，FBS(BI，美国)，心脑舒通(吉林敖东股份有限公司，中国)，化合物5：(26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-5α-呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇-3-O-{β-D-吡喃木糖基-(1→2)-〔β-D-吡喃木糖基-(1→3)〕-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)〕-β-D-吡喃半乳糖苷})、原薯蓣皂苷(由天津中医药大学中医药研究院张鹏老师提供)，无糖KRP(250 ml含NaCl 2.25 g/KCl 0.105 g/NaH2PO4·2H2O 0.032 5 g/ Na2HPO4·12H2O 0.180 25 g/MgSO40.067 5 g/CaCl20.081 g)，高糖KRP(在无糖KRP基础上加葡萄糖1.125 g)，CCK-8 (CCK-8，Dojindo，日本)，TNF-α(R&D，美国)，TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒、IL-1β试剂盒(北京四正柏)，37℃饱和湿度培养箱(Thermo，Forma3111型，美国)，倒置相差显微镜(Nikon，TE200，日本)，多功能读板机(TECAN公司，瑞士)，低温高速离心机(Beckman，64R型，美国)。

1.2bEnd.3细胞的培养 bEnd.3细胞培养于DMEM+20%FBS+1%双抗的培养液中，隔天换液，每5天用0.25%的胰酶消化传代，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。

1.3不同造模条件对bEnd.3细胞TNF-α、IL-6的影响 将传代的细胞接种到24孔板内生长至融合，对照组换成高糖KRP，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。模型组换成无糖KRP，在缺氧小室(94%N2+5%CO2+1%O2)中培养4 h，复氧时对照组换不含FBS的DMEM培养，模型组换含不同浓度的TNF-α(10、20、40 ng/ml)的DMEM，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。IL-6检测分别于复氧1 d、2 d、3 d收集上清，用鼠IL-6 ELISA试剂盒检测。TNF-α检测：分别于复氧1 d、2 d、3 d用220 μl细胞裂解液(10 ml TBS中含20 μl Triton X-100，20 μl甘油)冰上振摇处理10 min收集胞质裂解液，用鼠TNF-α ELISA试剂盒检测量(参照ELISA试剂盒说明书)。

1.4心脑舒通对正常培养的bEnd.3细胞活力的影响 取生长状态良好的bEnd.3细胞经0.25%的胰酶消化后制成单细胞悬液，接种到96孔板，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养，而后加入含有不同浓度心脑舒通(0.1、1.0、10.0、50.0 μg/ml)或单体(10.0 μg/ml)的DMEM培养基进行培养，24 h用CCK-8检测细胞活力。

1.5心脑舒通对缺氧再灌及炎症损伤的bEnd.3细胞活力的影响 取生长状态良好的bEnd.3细胞经0.25%的胰酶消化后制成单细胞悬液，接种到96孔板，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养至细胞融合后，进行细胞缺氧再灌及炎症损伤，考察心脑舒通及其单体成分对bEnd.3细胞活力的影响，细胞分组如下：对照组：将细胞培养液置换为高糖KRP溶液4 h，而后换成正常无血清DMEM培养液培养，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养20 h。模型组：将细胞培养液置换为无糖KRP溶液4 h，而后换成含TNF-α(40 ng/ml)无血清DMEM培养液培养，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养20 h。不同浓度加药组：将细胞培养液置换为无糖KRP溶液4 h，而后换成含不同浓度心脑舒通(0.1、1.0、10.0、50.0 μg/ml)或单体成分(10.0 μg/ml)的含TNF-α(40 ng/ml)无血清DMEM培养液培养，置5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养20 h。用CCK-8 试剂盒检测细胞活力。

1.6心脑舒通对缺氧再灌及炎症损伤的bEnd.3细胞胞质TNF-α的影响 将传代的细胞接种到24孔板内生长至融合，实验分组及细胞处理同上，复氧3 d后用磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞洗两遍，加入细胞裂解液冰上振摇处理10 min，收集胞质裂解液，用鼠TNF-α ELISA试剂盒检测TNF-α量。

1.7心脑舒通对缺氧再灌及炎症损伤bEnd.3细胞IL-6、IL-1β的影响 将传代的细胞接种到24孔板内生长至融合，实验分组及细胞处理同上，复氧3 d后收集细胞上清，用鼠IL-6、鼠IL-1β ELISA试剂盒检测。

1.8统计学方法 采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1不同浓度TNF-α对bEnd.3细胞TNF-α合成、IL-6分泌的影响 不同浓度TNF-α均能诱导bEnd.3细胞胞质TNF-α、上清IL-6的合成，且具有剂量依赖性。随着复氧时间的延长，胞质TNF-α和上清IL-6的分泌逐渐升高，故研究确定TNF-α的刺激浓度40 ng/ml，复氧时间定为3 d(表1)。

表1 不同造模条件对bEnd.3细胞TNF-α合成及IL-6分泌的影响

与前一TNF-α浓度组比较：1)P<0.05

2.2心脑舒通对正常bEnd.3细胞活力的影响 与对照组相比，心脑舒通各浓度组及单体成分对正常培养bEnd.3细胞活力没有影响，说明所采用浓度无细胞毒作用，并且不同浓度心脑舒通能显著促进bEnd.3细胞的增殖(P<0.05)，见表2。

2.3心脑舒通对缺氧再灌及炎症损伤的bEnd.3细胞活力的影响 与对照组相比，模型组能显著抑制bEnd.3细胞的增殖(P<0.05)；与模型组比较，心脑舒通(0.1、1.0 μg/ml)及其单体成分对缺氧再灌及炎症损伤的bEnd.3细胞活力恢复作用具有显著性差异(P<0.05)，心脑舒通10.0、50.0 μg/ml组能恢复细胞活力但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4心脑舒通对缺氧再灌及炎症损伤bEnd.3细胞TNF-α合成量的影响 与对照组相比，模型组能显著刺激bEnd.3细胞胞浆炎性因子TNF-α合成量(P<0.05)；与模型组比较，心脑舒通(0.1、1.0、10.0 μg/ml)及其单体成分能有效抑制缺氧再灌及炎症损伤的bEnd.3细胞胞质炎性因子TNF-α合成，差异有统计学意义(P<0.05)，心脑舒通50.0 μg/ml组差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.5心脑舒通对缺氧再灌及炎症损伤bEnd.3细胞IL-6释放量的影响 与对照组相比，模型组能显著刺激bEnd.3细胞上清炎性因子IL-6释放量(P<0.05)；与模型组比较，心脑舒通及其单体成分对缺氧再灌及炎症损伤的bEnd.3细胞上清炎性因子IL-6释放有降低作用，但差异无统计学意义(P>0.05)。单体成分化合物5抑制作用有显著差异(P<0.05)，见表3。

表2 心脑舒通对正常及模型损伤bEnd.3细胞活力的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较: 2)P<0.05,下表同

表3 心脑舒通对模型损伤bEnd.3细胞TNF-α合成量及IL-6释放量的影响

2.6心脑舒通对缺氧再灌及炎症损伤bEnd.3细胞IL-1β的影响 不同浓度TNF-α合并缺氧复氧刺激bEnd.3细胞，其合成及分泌IL-1β均非常少不以此作为模型选择依据。

3 讨 论

脑缺血再灌注过程中局部炎症因子、趋化因子及黏附分子的表达上调构成了缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础，随后白细胞向缺血区聚集和浸润，穿越血脑屏障进入脑实质，从而引起了脑缺血再灌注后炎症反应〔6〕。TNF-α是最重要的炎症因子，具有广泛的生物学效应〔7〕，能通过促进凝血、增加内皮细胞通透性及诱导黏附分子或其他炎性介质TNF-α、IL-6 等多种炎症因子的表达，从而引起一系列的炎症反应，加重脑缺血再灌注损伤〔8～10〕。本实验过程选择缺氧复氧合并TNF-α模型模拟脑缺血再灌注损伤的早期炎症反应〔11，12〕，通过检测局部炎症因TNF-α、IL-6、IL-1β，初步评价心脑舒通的抗炎作用及脑保护作用。

本实验结果显示，在不影响细胞活力的情况下，心脑舒通各浓度组及单体成分均能较好地抑制炎症因子TNF-α的释放。刘雪梅等〔13～15〕在其实验研究中表明脑缺血再灌注后大鼠的血清和脑内TNF-α和IL-1β大量表达，神经细胞凋亡数量显著增加，且组织结构疏松，尼氏小体明显减少，神经元丢失严重，而心脑舒通胶囊能有效抑制炎性因子TNF-α和IL-1β表达，降低神经细胞凋亡数量，从而保护受损的脑组织。本实验中也发现心脑舒通能降低小鼠脑微血管内皮细胞TNF-α的表达量，与其在体实验结果一致，进一步说明心脑舒通有效抑制炎性因子TNF-α的表达可能是其治疗脑缺血再灌注炎症损伤的途径之一。IL-1β是血浆和组织液中的主要形式，同时也是脑组织中的主要形式，参与了早期的炎症反应，IL-1β能够刺激黏附分子及诱导其他的炎性介质产生，促进炎症反应，而脑缺血再灌注可以诱导IL-1β的产生〔16〕。而本实验对炎症因子IL-1β的作用结果显示，不同复氧时间点及不同浓度TNF-α刺激后模型组与对照组均无统计学差异，其原因可能是由于IL-1β在bEnd.3细胞中的表达量较少所致。

IL-6是一种促炎症细胞因子，有研究表明，局灶性脑缺血再灌注损伤后的大鼠脑组织和外周血中均能观察到IL-6的高表达，说明IL-6参与了脑缺血再灌注损伤〔17〕。 IL-6是某些自身免疫性疾病中的关键炎症因子，与许多疾病的发生和转归都密切相关〔18，19〕。有研究表明，IL-6的表达量与炎症反应程度呈正相关，可以作为判断炎症损伤的灵敏指标〔20，21〕。本实验结果显示模型组IL-6的表达量呈明显上升趋势，说明IL-6参与了此炎症损伤反应过程。心脑舒通各浓度组及单体原薯蓣皂苷对炎症因子IL-6的表达有降低趋势，但未达到显著性差异。但其单体成分化合物5对IL-6的抑制具有显著性差异，说明心脑舒通对IL-6的表达有一定的抑制作用。 本研究表明心脑舒通能有效抑制缺氧再灌及炎症损伤bEnd.3细胞TNF-α、IL-6的表达，提示其对缺血再灌注损伤的早期炎症反应有一定的抑制作用而发挥脑保护作用。