HPLC法测定格列吡嗪控释片有关物质及方法学验证

方宗华,何 勇,高永好,于艳英,吴宗好

(合肥华方医药科技有限公司，安徽 合肥 230088)

本品是第二代磺酰脲类抗糖尿病药。主要作用为刺激胰岛β细胞分 泌胰岛素，适用于在充分进行饮食控制的基础上，治疗2型糖尿病患者的高血糖及其相关症状。格列吡嗪有关物质HPLC检查方法收载于中国药典2015年版，相关文献也有报道[1-6]，但都不适用于格列吡嗪控释片有关物质的检测，本文参照国内外药典，并经方法优化，建立专属性强、灵敏度高且通过前处理有效去除高分子辅料PEO干扰的格列吡嗪控释片有关物质测定HPLC法并对其进行方法学验证。

1 仪器与试药

日本岛津高效液相色谱仪(20AD,紫外检测器)；日本GL Sciences lnc WondaSil ?C18色谱柱(150×4.6mm，5μm)；日本紫外可见分光光度计(UV-1700)；METTLER TOLEDO分析天平(AG135)；METTLER TOLEDO实验室pH计(AG135)；格列吡嗪控释片( 实验室自制)； 格列吡嗪对照品和杂质Ⅰ对照品(中国药品生物制品检定所) ；乙腈( 色谱纯) ；水为纯化水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：C18；流动相：水(用磷酸调节pH值至3.7)为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱(0min，73%A；12min，73%；14min，63%；50min，63%；51min，73%；60min，73%)；检测波长为225nm。

2.2 专属性试验

2.2.1 酸破坏试验

供试品酸降解溶液的制备：取本品1片，用刀片切成4份，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜，超声振摇使溶解，加5mol/L盐酸溶液5mL，振摇，室温下放置4h，加5mol/L氢氧化钠溶液5mL中和，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，取上清液(续滤液)，即得。

2.2.2 碱破坏试验

供试品碱降解溶液的制备：取本品1片，用刀片切成4份，精密称定(205.46mg)，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜，超声振摇使溶解，放冷，加5mol/L氢氧化钠溶液5mL，振摇，室温下放置4h，加5mol/L盐酸溶液5mL中和，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，取上清液(续滤液)，即得。

2.2.3 氧化破坏试验

供试品氧化破坏溶液的制备：取本品1片，用刀片切成4份，精密称定(203.75mg)，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜，超声振摇使溶解，加30%双氧水溶液5mL，室温下放置2d，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，取上清液(续滤液)，即得。

2.2.4 高温破坏试验

供试品热降解溶液的制备：取本品1片，用刀片切成4份，精密称定(212.14mg)，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜，超声振摇使溶解，置80℃水浴下3h，放冷至室温，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，取上清液(续滤液)，即得。

2.2.5 光照破坏试验

供试品光降解溶液的制备：取本品1片，用刀片切成4份，精密称定(213.87mg)，置50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜，超声振摇使溶解，置强光下(4500lx±500lx)照射2天，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，取上清液(续滤液)，即得。

2.2.6 测定法

分别取上述溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.2.7 试验结果

本品在氧化条件下稳定，未产生新的杂质，原有的杂质含量也未见增大；在强酸条件下不稳定，虽未产生新的杂质，但原有杂质Ⅰ(杂质Ⅰ)和杂质G含量均增大；在高温、强光、强碱条件下不稳定，均能产生新的杂质及原有杂质含量增大；但我们所选色谱条件均能将主峰与杂峰以及杂峰与杂峰较好的分离，且空白溶剂和空白辅料不干扰检测。因此采用本法作为本品的有关物质检查，方法专属，可行。各色谱图见图1～图5。

图1 高温破坏色谱图

图2 光照破坏色谱图

图3 碱破坏色谱图

图4 酸破坏色谱图

图5 氧化破坏色谱图

2.3 杂质Ⅰ精密度试验

精密称取杂质Ⅰ对照品10.48mg，置100mL量瓶中，加甲醇75mL使溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中含1.048μg的溶液，精密量取上述对照品溶液20μL，连续进样6次，记录色谱图，以峰面积计算相对标准偏差RSD(%)。结果见表1。

表1 杂质Ⅰ精密度试验结果(n=6)

结果表明，本法精密度良好。RSD(%)=0.44%<2.0%。

2.4 杂质Ⅰ线性关系与线性范围

精密量取上述同一杂质Ⅰ对照品溶液2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL、25μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样量(ng) 对峰面积(A)进行线性回归，得回归方程。结果见表2。

表2 杂质Ⅰ对照品溶液线性回归方程结果

结果表明，格列吡嗪杂质Ⅰ的进样量在2.096ng～26.200ng之间，线性关系良好。

2.5 检测限与定量限试验

2.5.1 格列吡嗪检测限

精密称取格列吡嗪对照品10.78mg，置250mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置10mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比(S/N)=3∶1计算，本品最小检出量为0.2405 ng。表明本法测定格列吡嗪控释片中的有关物质灵敏度高，能满足有关物质的检测需要。

2.5.2 杂质Ⅰ检测限

精密称取杂质Ⅰ对照品10.66mg，置100mL量瓶中，加甲醇50mL，超声使溶解，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置25mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液2μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比(S/N)=3∶1计算，本品最小检出量为0.1228ng。表明本法测定格列吡嗪控释片中的杂质Ⅰ灵敏度高，能满足杂质Ⅰ的检测需要。

2.5.3 杂质Ⅰ定量限

精密量取杂质Ⅰ最低检出限项下的对照品溶液4μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比(S/N)=10∶1计算，本品最小定量限为0.3198ng。表明本法测定格列吡嗪控释片中的杂质灵敏度高，能满足杂质Ⅰ的限量检测需要。

2.6 杂质Ⅰ对照品溶液稳定性试验

精密量取上述同一杂质Ⅰ对照品溶液在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h后，分别进样20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积计算RSD(%)，考察杂质Ⅰ对照品溶液在室温放置48h的稳定性。结果见表3。

表3 杂质Ⅰ对照品溶液稳定性试验结果

结果表明，杂质Ⅰ对照品溶液在室温放置48h，峰面积无明显变化，RSD(%)=0.47%<2.0%。说明本品在室温放置48h稳定。

2.7 供试品溶液稳定性试验

取本品1片，用刀片切成4份，全量转移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜后充分振摇，超声使溶解，放冷至室温，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，即得，并在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h后，分别进样20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。考察样品溶液在室温放置48h的稳定性。结果见表4。

表4 有关物质供试品溶液稳定性试验结果

结果表明，本品在室温放置48h，主成分峰面积无明显变化，RSD(%)=0.72%<2.0%；杂质Ⅰ峰面积无明显变化，RSD(%)=0.72%；总杂峰面积无明显变化，RSD(%)=1.83%<2.0%；且未出现新的杂质。说明本品在室温放置48h稳定。

2.8 杂质Ⅰ中间精密度试验

取同一批格列吡嗪控释片，分别由不同的人配样，在不同的仪器上进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质Ⅰ含量，以含量(%)计算RSD(%)，结果见表5。

表5 杂质Ⅰ中间精密度试验结果

由上述试验结果可知：同一供试品(170301)，由不同的人，不同仪器，依法测定杂质Ⅰ含量，最低含量为0.0727%，最高含量为0.0733%，平均含量为0.0730%， RSD(%)=0.32%，表明用该法测定格列吡嗪控释片杂质Ⅰ含量，中间精密度良好。

2.9 杂质Ⅰ重复性试验

取同一批号(170301)格列吡嗪控释片1片，用刀片切成4份，全量转移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜后充分振摇，超声使溶解，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，作为供试品溶液，同法制备6份；分别量取上述杂质Ⅰ对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质Ⅰ含量，以含量(μg/片)计算RSD(%)，结果见表6。

由上述试验结果可知：同一批供试品(170301)重复测定6次，杂质Ⅰ平均含量为4.1693(μg/片)，RSD(%)=1.20%，表明用该法测定格列吡嗪控释片杂质Ⅰ含量重复性良好。

2.10 杂质Ⅰ准确度试验

采用加样回收法测定，取格列吡嗪控释片1片，用刀片切成4份，全量转移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜后充分振摇，超声使溶解，放冷至室温，共9份，分别精密加入杂质Ⅰ对照品溶液(10μg/mL)4mL(三份)，5mL(三份)，6mL(三份)，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，取续滤液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。另精密称取杂质Ⅰ对照品适量，加甲醇超声使溶解并用水定量稀释制成每1mL中约含1.0μg的溶液，作为对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算回收率。结果见表7。

表7 杂质Ⅰ准确度试验结果

结果表明，杂质Ⅰ平均回收率为98.79%，RSD(%)=0.82%<2.0%。说明本方法测定格列吡嗪控释片中的杂质Ⅰ准确度高，结果令人满意。

2.11 耐用性试验

取格列吡嗪控释片1片，用刀片切成4份，全量转移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜后充分振摇，超声使溶解，放冷至室温，用水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，作为供试品溶液；在下表中各变动因素条件下，精密量取供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表8。

表8 有关物质耐用性试验结果表(面积归一化法)

结论：由耐用性试验结果可见，在测定条件有小的变动时，主峰与杂质峰之间仍能分离良好；检查杂质个数相同；平均总杂为0.173%，RSD(%)=1.88%<2.0%，杂质总量变化较小，表明本方法耐用性良好。

2.12 三批样品的有关物质的测定

取本品1片，用刀片切成4份，全量转移至50mL量瓶中，加甲醇25mL，放置过夜，超声振摇使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，离心(必要时滤过)，取上清液(续滤液)作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取4-[2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基]苯磺酰胺(杂质Ⅰ)对照品10mg，置100mL量瓶中，加甲醇50mL超声使溶解，放冷，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为杂质Ⅰ对照品贮备液，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；再取格列吡嗪对照品10mg，置100mL量瓶中，加甲醇50mL超声使溶解，放冷，精密加入杂质Ⅰ对照品贮备液1mL，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定，用C18色谱柱；以水(用磷酸调节pH值值至3.7)为流动相A，乙腈为流动相B，进行线性梯度洗脱；检测波长为225nm。取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪，理论塔板数按格列吡嗪峰计算不低于20000，格列吡嗪峰与杂质Ⅰ峰的分离度应大于30。精密量取供试品溶液、对照溶液与对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有与杂质Ⅰ(4-[2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基]苯磺酰胺)保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过格列吡嗪标示量(格列吡嗪标示量按5.5mg计)的1.0%；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5%)；杂质总量不得过2.0%。

取自制样品三批(规格：5mg ，批号：170301、170302、170303)依照上述方法检查有关物质，结果见表9。

表9 三批中试样品有关物质检查结果

2.13 小结

经过不同色谱条件的筛选，确定选定色谱条件可有效分离主峰与杂质，通过分析方法的验证进一步说明了该分析方法准确可靠。适合格列吡嗪控释片有关物质测定。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取格列吡嗪对照品溶液和杂质Ⅰ对照品溶液，照紫外-可见分光光度法，以50%甲醇为空白溶液，在200～400nm波长范围内扫描，记录紫外吸收图谱。

结果显示格列吡嗪对照品溶液在227.5nm的波长处有最大吸收；格列吡嗪杂质Ⅰ对照品溶液在224.5nm的波长处有最大吸收。参考相关文献。选用225nm作为格列吡嗪控释片有关物质检查的测定波长。

3.2 色谱柱的选择

参考相关文献，其均为色谱柱C18。本文所用的色谱柱为日本GL Sciences公司生产的(150mm×4.6mm，5μm)WondaSil®C18柱色谱柱。