模拟微重力对大鼠甲状腺滤泡上皮细胞miRNA表达的影响

闫如意，张倍宁，李考，郑冬，宋淑军，吴继华，司少艳，周金莲，崔彦，张建中

随着载人航天技术的迅猛发展和空间探索活动的持续拓展，航天员在太空环境中的驻留时间不断延长，航天微重力环境对人体生理健康的影响已引起广泛关注[1-3]。航天飞行会导致航天员各系统一系列生理病理变化，内分泌系统首当其冲。甲状腺是人体重要的内分泌器官，一旦发生病变会引起机体多系统代谢障碍[4-6]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类大小为21～25nt的高度保守的小分子非编码RNA，位于内含子或非编码区的外显子及基因间区，作为基因表达的重要调控分子，几乎参与了机体所有的生理和病理过程[7-8]。本研究釆用旋转细胞培养系统(rotary cell culture system，RCCS)模拟微重力环境，观察大鼠甲状腺滤泡上皮细胞(Fisher rat thyroid cells line，FRTL-5)miRNA表达谱的变化并进行生物学功能分析，以期为航天员医监医保工作提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 FRTL-5细胞株培养及实验分组 FRTL-5购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，在含5%胎牛血清、6种激素替代物[5mU/ml促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、10μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、10ng/ml生长抑素、0.4ng/ml氢化可的松和10ng/ml甘氨酸-组胺酰-赖氨酸醋酸盐]和双抗(100μg/ml青霉素及100μg/ml链霉素)的F-12培养液中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，选取生长状态良好的第4～10代对数生长期细胞进行实验。细胞随机分为两组：模拟微重力(simulated microgravity group，SMG)组和正常重力组(normal gravity group，NG)组，每组3个样本。SMG组细胞与微载体共同置入高截面纵横比容器(high aspect ratio vessel，HARV)，而后在RCCS中培养；NG组置于37℃恒温箱中静置培养。

1.2 建立RCCS微载体培养体系 将预先准备好的Cytodex-3微载体放入HARV中，加入配好的培养基。将培养好的第4～10代对数生长期FRTL-5细胞以2×106/ml的密度接种于HARV，加满培养基，用注射器排尽气泡后放入RCCS。RCCS初始转速为8r/min，转动5min后停转5min，反复3次后调整转速至12r/min，定时观察并调整转速，以使微载体悬浮在培养液中。

1.3 样本采集 培养24h后将HARV中的混合液吸出至一次性塑料离心管中，静置15min后弃去上清，PBS洗涤3次，弃PBS，每个样本加2.5g/L胰蛋白酶2ml，吹打混匀，置于37℃、5%CO2培养箱孵育，8min后加入2ml培养基终止胰蛋白酶作用，轻轻吹打使细胞从微载体上脱落，通过细胞筛将细胞与微载体分离，细胞离心收集到1.5ml离心管内。NG组按常规洗涤、胰酶消化、细胞离心处理。

1.4 总RNA提取和质量检测 各样本中加入Trizol裂解，按照RNA分离试剂盒(Ambion抽提试剂盒)的操作步骤提取总RNA，利用NanoDrop定量并经Agilent 2100检测RNA完整性。

1.5 miRNA芯片及数据处理 RNA经质检合格后，按照芯片标准流程分别进行样品标记、芯片杂交、洗涤及扫描。利用Feature Extraction软件(version 10.7.1.1，Agilent Technologies)从扫描图片上提取数据，将原始数据导入Genespring软件(version 13.1，Agilent Technologies)，进行标准化及后续数据分析。利用t检验及倍数变化关系值进行差异miRNA的筛选，筛选标准为上下调倍数变化值≥2且P＜0.05。

1.6 反转录实时定量PCR(reverse transcriptionquantitative real-time PCR，RT-qPCR)验证芯片结果 根据芯片检测结果，选取原始信号值强、差异显著的3个miRNA进行检测，验证芯片数据的可信度。设计特异性引物，以5S为内参照，取各组样本总RNA反转录成cDNA，进行PCR扩增：95℃5min、95℃ 10s、60℃ 30s，40个循环后利用熔解曲线检测产物特异性。将miRNA表达水平进行标准化处理，采用2–ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.7 功能分析

1.7.1 靶基因预测 使用Genespring13.1软件，分别用microRNAorg和TargetScan数据库共同对差异miRNA进行靶基因预测，取二者交集作为miRNA潜在调节靶基因。

1.7.2 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析统计每个GO条目中所包括的靶基因个数，计算每个GO条目中靶基因富集的显著性。P值越小，靶基因在该GO条目中出现的富集程度越高，P＜0.05表示显著富集。

1.7.3 京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 利用KEGG数据库对靶基因进行通路分析，计算每个KEGG通路条目中靶基因富集的显著性。P值越小，靶基因在该通路条目中富集程度越高，P＜0.05表示显著富集。

1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量数据以表示，多样本比较，在满足方差齐性的条件下，采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA芯片检测结果 比较SMG组与NG组FRTL-5芯片数据(倍数变化值≥2且P＜0.05)，筛查发现81个差异表达的miRNA。相较于NG组细胞，SMG组53个miRNA明显上调，28个miRNA明显下调。选取差异显著且原始信号值较强的miRNA进行非监督层次的聚类分析，将结果制成miRNA差异表达热图(图1)。

图1 微重力环境下大鼠甲状腺滤泡上皮细胞差异表达的miRNA聚类分析Fig. 1 Hierarchical cluster analysis of differentially expressed miRNAs of thyroid follicular epithelial cell line under microgravity environment

2.2 RT-qPCR检测结果 根据芯片检测结果，选取rno-let-7b-3p、rno-miR-346、rno-miR-494-3p进行检测，验证芯片数据的可信度。设计引物序列如下：rno-let-7b-3p：CTATACAACCTACTGCCTTCCC；rno-miR-346：TGTCTGCCTGAGTGCCTGCCTCT；rno-miR-494-3p：TGAAACATACACGGGAAACCTCT；内参5S：GGAGACCGCCTGGGAATA。对RT-qPCR检测结果用2–ΔΔCt法相对定量分析显示，以NG组为对照，SMG组rno-let-7b-3p、rno-miR-346的2–ΔΔCt值分别为0.11和0.03，均明显下调(P＜0.05)，而rno-miR-494-3p的2–ΔΔCt值为1.98，表达明显上调(P＜0.05)，表明RT-qPCR结果与miRNA芯片结果一致。

2.3 靶基因预测及GO分析结果 对差异显著且原始信号值较强的miRNA进行分析和靶基因预测，结果发现每个miRNA潜在调控众多的靶基因。根据显著富集结果(P＜0.05)，按P值的-log10排序，整理出显著富集且与FRTL-5生长及功能相关的前20条基因本体功能条目(图2)，-log10(P)值越大，该条目越显著。结果显示，预测靶基因与细胞老化、凋亡、对低氧的反应、转录、细胞黏附及炎症反应等生物学过程相关。

2.4 靶基因KEGG信号通路分析结果 根据显著富集结果(P＜0.05)，按P值的-log10排序，整理出显著富集且与FRTL-5生长及功能相关的前20条信号通路条目(图3)。结果显示，预测靶基因与低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)信号通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG)信号通路、叉头框转录因子O(fork head box transcription factor O，FoxO)信号通路、钙信号通路、Ras相关蛋白1(ras-related protein 1，Rap1)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinaseprotein kinase B，PI3K-Akt)信号通路、鞘脂信号通路、溶酶体、甲状腺激素信号通路相关。

图2 微重力环境下大鼠甲状腺滤泡上皮细胞差异表达的miRNAs功能分布(GO分析)Fig. 2 Function distribution of differentially expressed miRNAs of thyroid follicular epithelial cell line under microgravity environment by GO analysis

图3 微重力环境下大鼠甲状腺滤泡上皮细胞差异表达的miRNAs功能分布(KEGG分析)Fig. 3 Function distribution of differentially expressed miRNAs of thyroid follicular epithelial cell line under microgravity environment by KEGG analysis

3 讨 论

航天研究及实践证实，失重环境对甲状腺有明显影响。由于失重造成的体液头颈向分布，甲状腺处于持续充血状态，加之甲状腺组织细胞本身对重力变化的应激反应，会导致甲状腺结构和功能异常，并容易引发甲状腺疾病。甲状腺的生理作用及病理变化影响非常广泛，并涉及垂体轴的系统调节，机制十分复杂[4,9]。一旦航天员在航天飞行过程中出现甲状腺功能异常以及由此引发的各种特殊情况，病情演变充满变数，而救治条件极度受限，防控不当可影响航天员的健康安全和任务执行能力。面对迅速发展的中长期航天飞行任务，航天员甲状腺功能状态的进一步研究和病理影响的有效防控已成为目前我国航天医学亟待解决的重要问题之一[9]。

研究证实，失重或模拟失重对甲状腺有重要影响[9]。Infanger等[10]在模拟微重力条件下培养HTU-5细胞12h后，观察到细胞形成多细胞球状体，细胞外基质蛋白和β1-整联蛋白增加，细胞角蛋白丝从中心延伸，较对照组细胞增稠、聚结和缩短。Kossmehl等[11]发现在模拟微重力条件下培养HTU-5细胞24h后细胞凋亡加剧，caspase-3激活，Fas和Bax表达增加。Kopp等[12]通过对模拟微重力环境培养7d及14d的甲状腺细胞进行研究，发现白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)等促血管生成因子对失重条件敏感。有学者在微重力环境下对甲状腺细胞及甲状腺乳头状癌细胞的相关基因学改变和分子调控途径进行研究并取得了重要进展[13-15]。

miRNA的发现是分子生物学的重要突破，作为高度保守的内源性调控RNA，miRNA可在转录后水平抑制靶mRNA，已经成为各种生物学事件的关键调节剂，几乎参与了机体所有的生理和病理过程，包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等[7-8]。研究微重力条件下甲状腺miRNA的表达差异，可为航天失重环境中内分泌系统的相关变化及疾病防控提供新的思路。

本研究采用miRNA芯片技术比较FRTL-5细胞在模拟微重力环境和正常重力条件下培养24h后miRNA的表达谱差异，共发现81个差异表达的miRNA，相较于NG组细胞，SMG组53个miRNA明显上调，28个miRNA明显下调；GO分析显示这些差异miRNA主要参与了细胞老化、凋亡、对低氧的反应、转录、细胞黏附及炎症反应等生物学过程。根据文献报道，参与失重环境下控制细胞生命活动的信号通路有NF-κB信号通路、Notch信号通路、MAPK信号通路、热休克信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、钙离子信号转导通路、VEGFR-2/VEGF-A信号通路、凋亡相关信号转导通路和Rho信号转导通路等[16-17]。本研究通过KEGG分析发现，差异表达的miRNA参与的主要通路有NF-κB信号通路、MAPK信号通路、Notch信号通路、钙离子信号转导通路、凋亡相关信号通路等，这从另外一个方面说明miRNA在失重环境下参与控制细胞生命活动的信号通路中扮演着重要作用。本研究还发现，HIF-1信号通路居相关通路之首。根据文献报道，HIF-1不但可以被低氧诱导，还可以被其他因素如高温、低温、辐射、炎症反应等诱导，进而影响细胞存活、生长、分化及凋亡[18]。本课题组前期研究发现，尾悬吊模拟失重大鼠卵巢组织中HIF-1α蛋白及mRNA的表达发生了明显变化，提示卵巢HIF-1α表达变化与失重应激反应和失重耐受有密切关系[19]。本研究芯片数据分析显示，rno-let-7b-3p、rnomiR-346、rno-miR-494-3p均参与了HIF-1通路的相关活动，但具体作用及机制还有待进一步探讨。

本研究的芯片分析及RT-qPCR均证实SMG组的rno-let-7b-3p表达较NG组显著下调。Let-7是许多生物体中基因表达的关键调节剂，Let-7家族(let-7a，let-7b，let-7c，let-7d，let-7e，let-7f，let-7g和let-7i)具有高度的序列和功能保守性，也是正常甲状腺中表达最多的miRNA之一，在甲状腺发育、功能及疾病发生过程中起重要作用。let-7可在转录后水平负向调控凋亡相关因子Fas的表达，而Fas表达增加会抑制let-7的生物合成，即let-7和Fas之间是一种双向调控关系[20-21]。另有研究证实，微重力培养甲状腺细胞24h后可观察到细胞凋亡及Fas的表达量增加[9]。本研究结果与文献报道基本吻合，但对于let-7b-3p在凋亡相关通路中的精确调控仍需进一步深入研究。

微重力不仅影响细胞的增殖、分化，而且对其功能也会有不同程度的影响[16-17]。本研究通过KEGG分析，发现部分靶基因如白细胞分化抗原38(cluster of differentiation 38，CD38)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)及白细胞分化抗原164(cluster of differentiation 164，CD164)等参与了钙信号、过氧化物酶体和溶酶体等通路调节，这些通路已经被证实与甲状腺激素调节密切相关[22]；而对let-7b-3p、miR-346、miR-494-3p相关通路的分析表明，这3个miRNA无一例外地参与了以上通路的调节。分析认为，在微重力特殊环境中，这些差异miRNA有可能参与了对甲状腺激素的调控，但其具体机制及相互关系尚需进一步研究。