人参中9种皂苷的HPLC测定

李文峥 侯志广*

（1 广东边防武警总队医院中药房，广东 深圳 518000；2 吉林农业大学资源与环境学院，吉林 长春 130118）

人参（Panax ginseng C.A.Meyer.）为五加科人参属植物的干燥根，它与三七、西洋参等著名药用植物是近亲。产于吉林、辽宁、黑龙江、河北（雾灵山、都山）、山西、湖北等地，人参具有卓越及独特的药用价值[1-3]，经药理学验证，皂苷是其主要的活性成分，因此皂苷的含量高低决定了其品质。因此，建立一个简单、经济、有效、能同时检测多种皂苷的分析方法意义重大。目前人参皂苷分析方法主要有：HPLC、GC、TLCS、MS、HPCE、分光光度法、比色法、薄层光密度法、棒状薄层扫描法、酶免疫分析法、液滴逆流色谱法等[4-7]。借助高效液相色谱法，本实验测定了人参中9种皂苷的含量，以期为人参的质量控制与质量标准的制定等提供科学依据。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪（Agilent 1200，四元泵，DAD检测器，美国安捷伦公司）；HP Chemstation 化学工作站（美国安捷伦公司）；LD-06A型高速中药粉碎机；人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rf均购自中国药品生物制品检定所；固相萃取柱SPE C18（1000 mg填料）；人参购于吉林省抚松县，经吉林农业大学农业部参茸中心鉴定为人参（Panax ginseng C.A.Meyer.）的干燥根；甲醇为色谱纯，其他均为分析纯，实验用水为一级水，所有试剂均经过0.45 µm微孔滤膜过滤及超声脱气处理。

2 方法与结果

2.1 优化条件

2.1.1 洗脱液配比的优化：为了明确洗脱效果，通过对不同体积配比的乙醇和水进行实验，论证表明，70%乙醇水溶液是最优洗脱液配比溶液，既能确保回收率，又会减少被洗脱的杂质组分。

2.1.2 洗脱液体积的优化：用40 mL体积的70%乙醇溶液做为洗脱剂洗脱，分段接收洗脱液，同时测定，其结果表明用25 mL 70%乙醇溶液做为洗脱剂，检测回收率符合要求。

2.1.3流动相的优化：人参试样，成分复杂，干扰较多，易出现假阳性的情况。采用水溶液和甲醇作为流动相，调整流动相比例，使用不同的流速对样品检测，优化选择，结果表明上述梯度洗脱程序为分析的最佳洗脱程序，在该条件下分析测试，待测组分皂苷与试样中杂质得到较好的分离和满意的收率，避免出现假阳性的情况。

2.2 色谱条件：色谱柱为ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；DAD检测器；柱温为47 ℃；检测波长202 nm；进样体积10 μL；流速0.5～0.8 mL/min；流动相：A为甲醇，B为水溶液，梯度洗脱程序为：0～20 min，52%A，48% B，流速0.5 mL/min；20～23 min 52%～57% A，43%～48% B，流速0.5～0.8 mL/min，23～36 min 57%A，43% B，流速0.8 mL/min；36～39 min 57～65% A，43%～35%B，流速0.8 mL/min；39～71 min 65%A，35%，B流速0.8 mL/min；71～74 min 65%～52% A，35%～48%B，流速0.8～0.5 mL/min；74～84 min 52% A，48%B流速0.5 mL/min。9种人参皂苷混合对照品溶液在上述色谱条件下进样10 μL，得到其分离色谱图及9种人参皂苷样品色谱图1，9种人参皂苷样品色谱图见图2。

图1 9种人参皂苷标准品色谱图（1-Re；2-Rg1；3-Rf；4-Rg2；5-Rb1；6-Rc；7-Rb2；8-Rb3；9-Rd）

图2 9种人参皂苷样品色谱图（1-Re；2-Rg1；3-Rf；4-Rg2；5-Rb1；6-Rc；7-Rb2；8-Rb3；9-Rd）

2.3 对照品溶液的制备：精密量取人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rf对照品适量。用甲醇配制成不同质量浓度的混合标准溶液。

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 样品提取：准确称取人参样品2 g（精确至0.001 g），加入100 mL乙醚于索氏提取器中，提取1 h，弃去乙醚，待残渣中乙醚挥干后，再加入甲醇回馏8 h。

2.4.2 样品净化

2.4.2.1 SPE C18柱的预处理：先用10 mL去离子水淋洗SPE C18柱，然后用10 mL的甲醇进行活化，再用10 mL 去离子水平衡。待水与柱筛板近平时上样。

2.4.2.2 提取液的处理：提取液在60 ℃水浴条件下，经旋转蒸发仪减压浓缩至近干，氮气吹干，加入4 mL去离子水充分摇匀。取2 mL样液注入预先活化好的SPE C18柱中，待液面与柱筛板近平时，倒入10 mL去离子水淋洗SPE C18柱，弃去流出液，待淋洗液液面与柱筛板近平时，加入25 mL乙醇溶液（4.1）洗脱SPE C18柱，收集洗脱液于50 mL刻度试管中，氮气吹至25 mL以下，用甲醇定容至25 mL，混匀后，用0.2 μm滤膜过滤，备用。

2.5 线性关系：精密量取人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rf对照品适量。采用甲醇配制成不同质量浓度的标准溶液，对各种皂苷体的峰面积（Y）与质量浓度（x，mg/L）进行线性回归分析，得到相应人参皂苷的回归方程，结果见表1。

表1 9种人参皂苷的线性回归方程

2.6 精密度试验：精密吸取不同人参皂苷的对照品溶液10 μL，连续重复进样5次，9种人参皂苷面积的RSD在0.82%～1.75%，表明精密度良好。

2.7 重复性试验：称取5份同一批号的人参样品，获得不同人参皂苷体的含量，对应RSD为0.98%～2.87%。表明本方法的重复性较好。

2.8 回收率试验：准确称取人参样品2 g索氏提取器中，加入一定量皂苷对照品混合溶液，重复5份，对应的回收率、RSD结果见表2。

表2 9种人参皂苷的加样回收率结果（n=3）

3 讨 论

人参中的成分比较复杂，在色谱分离实验中，通过对流动相及其比例的优化筛选，最终样品在甲醇和水梯度洗脱的条件下，9种皂苷能够较好地分离。在样品净化时采用SPE柱，净化效果较好，减少了杂质的干扰。总的来说，该方法准确，快速，重现性好，灵敏度高，精密度也较好。便于快速分析，具有较高的应用价值。

作为最常见的中药材，人参皂苷含量的个体差异较大，该方法的建立对人参的品质评价有重要的参考意义。