一种改良的红豆杉成熟针叶总RNA 提取方法

李德文 杨 超 付金颖 刘 英 于莉莉 付玉杰

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室， 哈尔滨 150040)

1 引 言

紫杉醇(Taxol)是从红豆杉属(TaxusLinn.)植物中分离出的一种二萜类生物碱，因具有广谱的抗癌活性和独特的抗癌机制而备受青睐。研究者通过研究紫杉醇生物合成过程的某些关键性酶的发现、克隆和高效表达，实现紫杉醇高效、稳定生产[1]。近年来，研究者已从红豆杉(Taxuschinensis(Pilger) Rehd.)愈伤组织、悬浮细胞和幼嫩针叶材料中克隆了紫杉醇生物合成相关的关键酶基因[2]，并对这些基因转录水平的表达与紫杉烷类化合物的合成之间的关系展开了相关研究[3]。红豆杉分子标记研究是以基因组DNA为基础，围绕遗传变异与亲缘关系和紫杉醇含量方面展开[4,5], 文献[6,7]利用红豆杉转录组进行高通量测序进而发掘基因表达谱多态性标记(EST-SSRs)，以及开展红豆杉遗传多样性的分析、分子标记辅助育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘。目前在红豆杉分子生物学研究方面已经取得了很大进展，但是围绕环境因子对紫杉醇合成路径基因表达调控开展的工作较少，基于以红豆杉成熟针叶为材料的RNA提取还比较困难，因此需要建立一种稳定高效的成熟针叶RNA提取体系。

在RNA提取过程中首先需要加入适量蛋白质变性剂，如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯仿、异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠(SDS)等使蛋白质变性与核酸分离、沉淀[8]，即TRIzol法(异硫氰酸胍)[9]、CTAB法[10]、SDS-酚法[11]等是几种常见的RNA提取方法。影响RNA提取效果的主要因素包括多酚、多糖、蛋白及DNA的污染等，因此，RNA提取方法并不是通用的，不同植物或者同一植物不同组织RNA提取都可能需要采用不同的处理方法。由于杉科针叶中含有较多难以去除的萜烯、多糖、多酚等代谢物[12]，传统的RNA提取方法从产量、产物质量上都不能满足目前红豆杉研究的需要。本研究根据RNA提取要点，以红豆杉属代表性植物南方红豆杉针叶为材料，提出一种改良后的成熟针叶RNA提取方法，得到的RNA不仅完整度好，而且产率高，有利于开展红豆杉成熟针叶紫杉醇合成路径基因表达分析以及转录组等分子生物学的研究。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Nano Photometer N60超微量紫外分光光度计、Hettich Mikro220R 低温高速离心机(天力科技开发有限公司); 844-070-682 EasyCycler Gradient 96 PCR仪(北京元业伯乐有限公司); DYCP-31DN 水平电泳槽和核酸电泳仪(北京六一公司); Dolphin-Doc Plus凝胶成像系统 (北京铭泰佳科技有限公司); Hirayama HVE-50高压灭菌锅(上海天呈科技有限公司); DFD-700 恒温水浴锅(邢台润联科技开发有限公司)。

TRIzol(上海生工公司); 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，分析纯，龙腾化工); 焦炭酸二乙酯(DEPC，纯度≥97%) 、LiCl (分析纯)购于纳川生物公司; NaAC(分析纯)、十二烷基磺酸钠(SDS, 分析纯)、乙二胺四乙酸(EDTA，分析纯)、 NaCl (分析纯)、KAC (分析纯)、无水乙醇(分析纯)、氯仿(分析纯)、异戊醇(分析纯)、β-巯基乙醇(β-ME，纯度≥99.9%)购于天津永大化学试剂公司; 聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分析纯)、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP，分析纯)购于美国Simga公司; 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris，分析纯，上海研生公司)。实验用水为超纯水。

2.2 实验前处理

RNA提取之前，所有需要使用的实验用品在37℃下用0.01% DEPC溶液过夜处理，后在高温高压下灭菌(121℃，20 min)。研钵在180℃下烘烤6 h。所有溶液的配制需在37℃下用0.1% DEPC处理水过夜处理后配制，并高温高压灭菌处理。

2.3 实验材料

选取红豆杉属代表性植物南方红豆杉(Taxuschinensis(Pilg.)Rehd.var.mairei(LemeeetLevl.)三年生的幼苗为实验材料，栽培于东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室温室中，分别选取新鲜的幼嫩针叶和成熟针叶。

2.4 RNA提取方法

2.4.1TRIzol方法分别称取新鲜嫩针叶和成熟针叶0.1 g，放于液氮中研磨。加入1 mL TRIzol试剂振荡混匀(30～60 s)，冰上放置10 min， 4℃ 12000 r/min离心10 min。吸取上清液转到新管中，加入200 μL氯仿，振荡混匀(30～60 s)，室温放置5 min， 4℃ 12000 r/min离心10 min。吸取上清液，加入预冷的异丙醇500 μL，振荡混匀(30～60 s)，4℃放置20 min， 12000 r/min离心10 min，得到RNA白色片状沉淀。弃去上清液，加入1 mL 75%(V/V)乙醇，颠倒并涡旋5～10 s， 4℃ 12000 r/min离心3 min，重复两次，弃上清液，室温干燥5～10 min。加入30 μL DEPC处理水溶解RNA，——70℃保存备用。

2.4.2CTAB法称取新鲜成熟针叶0.5 g，液氮研磨，加至60℃预热的1 mL CTAB提取液中 (2% CTAB、2% PVP、100 mol/L Tris-HCl (pH=8)、25 mol/L EDTA、2 mol/L NaCl, 灭菌后加入0.1 g PVPP和67 μLβ-ME); 混匀后于60℃烘箱反应15 min; 4℃ 12000 r/min离心10 min，取上清液，加入700 μL氯仿-异戊醇(24∶1,V/V)，剧烈振荡混匀，重复一次; 4℃12000 r/min离心10 min，取上清液，加入600 μL异丙醇，-20℃沉淀30 min。4℃ 12000 r/min离心10 min，弃上清液，再离心2 min; 沉淀用75%乙醇洗涤两次，真空干燥2～5 min; 加入150 μL DEPC溶解RNA，再加入50 μL 8 mol/L LiCl，4℃沉淀，过夜。次日，4℃12000 r/min离心20 min，收集沉淀。用75%乙醇洗涤2次，真空干燥5～10 min; 加入30 μL DEPC处理水，-70℃保存备用。

2.4.3SDS-酚法称取新鲜成熟针叶0.1 g，液氮研磨，转入1.5 mL离心管中，加入1 mL SDS提取液 (0.1 mol/L NaAC，50 mol/L EDTA (pH=8)、1 mol/L NaCl、3% PVP)，调节至pH 5.5后加3% (m/V)SDS，用前加5%(V/V)β-ME ，混合后在65℃水浴10 min，4℃ 12000 r/min离心10 min。取上清液，分别加入1/2体积的水饱和酚和氯仿，置冰上10 min，4℃ 12000 r/min离心10 min。取上清液，加入1/3体积的5 mol/L KAC (pH=4.8)和1/3体积的无水乙醇，冰上静置30 min，4℃ 12000 r/min离心10 min。 取上清液，加2倍体积的乙醇，在冰上沉淀核酸2 h，然后4℃12000 r/min离心10 min，弃上清液。加入700 μL预冷的NaAC (3 mol/L, pH=5.2)，冰上放置5 min，4℃ 12000 r/min离心20 minn。加入75 μL DEPC溶解，再加入等体积4 mol/L LiCl，4℃沉淀过夜后，4℃12000 r/min离心30 min，弃上清液，加入70%乙醇清洗沉淀，离心，弃上清液， 干燥5～10 min，溶于50 μL DEPC处理水中。

2.4.4改良CTAB-LiCl法取新鲜红豆杉成熟针叶液氮研磨后的样品0.5 g，加入经过65℃预热的提取裂解缓冲液1 mL，RNA提取缓冲液配制: 0.1 mol /L Tris-HCl (pH= 8.0)，0.05 mol/L EDTA (pH=8.0)， 2% CTAB (W/V)，2% PVP (W/V)，2 mol /L NaCl，在使用前加入5%β-ME (V/V)，涡旋剧烈振荡1 min，65℃ 温育30 min，期间混匀数次。加等体积氯仿-异戊醇(24∶1，V/V)，剧烈振荡2 min，13000 r/min 离心10 min，吸取上清液。反复抽提2次。加入1/4 体积的LiCl(6 mol/L)，混匀，-20℃放置2～3 h，13000 r/min 离心10 min，去上清液，沉淀RNA中加入1/20体积DEPC处理的无菌水，加入1/20体积NaAC (3 mol/L, pH=5.2)，再加入预冷的无水乙醇1.2 mL混匀，于——70℃放置30 min，13000 r/min离心10 min，去上清液，沉淀RNA。用70%乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清液，并干燥5～10 min， 溶于40 μL DEPC处理水。

2.5 RNA的纯度和产率分析

将不同方法提取的总RNA样品稀释50倍，用超微量紫外分光光度计检测260 nm和280 nm 处的吸光值，用A260/A280比值衡量样本的纯度，并计算RNA的产率。取4 μL RNA样品与2 μL (6 × Loading-buffer)混匀，用1×TAE电泳液和1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统下拍照成像。

2.6 cDNA的合成和PCR(RT-PCR)

cDNA的合成采用BeyoRTTMⅡ cDNA第一链合成试剂盒(江苏南京碧云天生物公司)，具体步骤:3 μL RNA(100～500 ng/μL)、1 μL Oligo(dT)(0.5 μg/μL)和8 μL ddH2O混匀，65℃孵育5 min，置于冰上冷却，再依次加入4 μL 缓冲液(5×Buffer)、1 μL RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor，20 U/μL)、2 μL dNTP、1 μL 逆转录酶(RT-MLV，200 U/μL)，共20 μL，42℃反应1 h，80℃反应10 min，置冰上终止反应，得到单链cDNA。PCR反应总体系20 μL:模板cDNA 2 μL、引物18S各1.5 μL，PCR-Mix (Easy-LoadTMPCR Master Mix，江苏南京碧云天生物公司) 10 μL、ddH2O 5 μL。PCR扩增体系: 94℃ 3 min， 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30次循环，72℃ 10 min，4℃保温。引物序列应用报道的红豆杉18S rRNA序列[13](18S-F:5′-GTGCACATCCCGACTCT-3′, 18S-R:5′-GCGATCCGTCGAGTTATCAT-3′)进行扩增。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

3 结果与讨论

3.1 不同方法提取红豆杉针叶总RNA的质量分析

采用4 种方法提取红豆杉成熟针叶的总RNA，结果表明，不同方法提取的RNA质量差别较大。首先采用TRIzol法提取幼嫩针叶和成熟针叶的RNA，以幼嫩针叶为材料，提取产物电泳后28S和18S条带清晰， RNA未降解(图1A) ，表明简单快捷的TRIzol法适合幼嫩针叶RNA的提取。以成熟针叶为材料，TRIzol法提取RNA电泳时仅有5S条带出现(图1B)，表明RNA发生了降解。与幼嫩针叶相比，液氮研磨后加入TRIzol试剂，缓冲液体系呈深绿色(图2)，一方面是由于针叶中酚类物质的干扰，酚类物质氧化影响缓冲液的颜色，另一方面可能由于成熟针叶中代谢产物较幼嫩针叶含量增多，如紫杉醇、10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ等在叶中积累，含量升高[14]，其中一类或者一种产物明显干扰TRIzol作用，导致缓冲液呈黏稠态，没有抑制RNAase活性，导致提取产物RNA降解。说明TRIzol法只适用于红豆杉幼嫩针叶RNA的提取，因此对成熟针叶的RNA提取方法进行筛选和改进。采用CTAB法提取成熟针叶的RNA，RNA产物电泳后条带明显弥散，拖尾严重，存在严重的降解现象，并且有明显的DNA条带干扰(图3C); RNA样品中有DNA污染时，会影响基因表达量的测定。采用SDS-酚法提取RNA，电泳后28S和18S条带分辨不清晰(图1D)，RNA发生降解; 采用改进的CTAB-LiCl法提取RNA，电泳后，28S和18S条带清晰，亮度高， DNA污染较少， RNA质量好(图1E)。改进的CTAB-LiCl法综合CTAB法和SDS-酚法，使用氯仿/异戊醇可将不稳定的DNA及其它杂质抽提出来，而稳定的RNA留于上清液中，从而将RNA和DNA有效分离。耿学军等[15]在提取沙葱总RNA时加入250 μL 3 mol/L NaAc溶液去除DNA，提取效果良好，研究表明，在酸性条件下RNA稳定性高于DNA，NaAc可选择性沉淀RNA，并将DNA留在溶液中。因此，CTAB-LiCl法结合酸性条件、高盐溶液(3 mol/L NaAc)和LiCl等减少DNA、多糖污染的步骤，最终提取的RNA质量完整、产率高。

图1 4种方法提取红豆杉针叶中总RNA的电泳检测结果TRIzol法提取红豆杉的(A)幼嫩针叶和(B)成熟针叶的RNA; (C)CTAB法提取红豆杉成熟针叶的RNA; (D)SDS酚法提取红豆杉成熟叶的RNA; (E)改良CTAB-LiCl法提取红豆杉成熟针叶的RNA。Fig.1 Total RNA electrophoresis results from needles by four methodsExtraction of (A) young needles and (B) mature needles of Taxus chinensis by TRIzol method; (C) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by CTAB method; (D) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by SDS phenol method; (E) Extraction of mature needles of Taxus chinensis by improved CTAB-LiCl method

图2 (A) 红豆杉针叶(a,成熟针叶; b, 为幼嫩针叶); (B) 研磨0.1 g材料中加入1 mL TRIzol试剂后的裂解液(a,成熟针叶，b,幼嫩针叶)Fig.2 (A) Taxus chinensis (Pilger) Rehd.) needles (a, mature needles; b, younger needles); (B) 1 mL TRIzol solution was added into 0.1 g of grinding material (a, mature needles, b, young needles)

3.2 不同方法提取红豆杉针叶总RNA的纯度及其产率

采用紫外分光光度法分析RNA的纯度与产率，相应的A260/A280比值常用于核酸样品纯度评价。质量较好的核酸样品的标准为A260/A280>1.8[16]。本研究检测TRIzol试剂盒法提取出红豆杉幼嫩和成熟针叶的RNA，及其余3种方法提取红豆杉成熟针叶的RNA的质量，结果表明，TRIzol法提取RNA的A260/A280>1.8，表明RNA中的蛋白和其它物质干扰较少，CTAB法和SDS-酚法提取RNA的A260/A280<1.8，表明RNA中蛋白或者其它有机物的污染比较明显，而CTAB-LiCl法提取RNA的A260/A280在1.9～2.0之间，表明RNA受污染比较少。由于LiCl是一种强脱水剂，可以降低RNA的溶解度，使部分多糖留在溶液中进而选择性地沉淀大分子RNA[17]，对于不同的植物，所用LiCl的浓度有所不同，在提取白木香RNA中选用4 mol/L LiCl选择性沉淀RNA[18]，在紫藤种子RNA提取中选择8 mol/L LiCl沉淀[19]。本研究中采用的CTAB-LiCl法，通过优化后，选择在提取上清液中加入6 mol/L LiCl，适合于除去多糖等一些物质的干扰，提高RNA的质量。

RNA浓度分析表明，TRIzol法提取红豆杉幼嫩针叶RNA浓度为135 μg/mL (表1)，成熟针叶中提取RNA不完整，未测出RNA浓度; 应用CTAB法、SDS-酚法、CTAB-LiCl法提取的红豆杉成熟针叶RNA浓度分别为269、205和428 μg/mL。

将不同方法提取的总RNA样品稀释50倍，用超微量紫外分光光度计检测在波长260 nm和280 nm 处的吸光值，用A260/A280值衡量样本的纯度，并计算RNA的产率(yield):

RNA yield (μg/g)=A260N40(μg/mL)V/W

(1)

式中，N为稀释倍数， 40 μg/mL相当于1个A260单位的RNA含量，V为体积，W为样品重量(g)。 取4 μL RNA样品与2 μL (6 × Loading-buffer)混匀，用1×TAE电泳液和1.2%的琼脂糖凝胶分离，在凝胶成像系统下拍照成像。RNA产率分析结果表明，CTAB-LiCl法提取RNA的产率最高，分别为CTAB法和SDS-酚法提取的RNA产率的1.37和1.24倍(表1)。针叶植物中多酚含量比较高，氧化后的多酚物质会结合于RNA上，通过离心将其一并去除，降低了RNA的产率[12]。王玉成等[8]研究发现，RNA提取过程中加入适量β-ME强还原剂，可避免多酚物质被氧化。伍艳芳等[20]和张燕梅等[21]分别在提取樟树叶片、剑麻组织的总RNA时，均在预处理液中加入2%β-ME，抑制酚类物质的干扰，而刘洁等[12]研究改良云杉针叶总RNA时，加入5%β-ME。本实验经过优化选择加入5%β-ME，有效抑制了酚类物质对RNA的影响，提高了RNA的产率。

表1 4种方法提取红豆杉针叶RNA的纯度及产率比较

Table 1 Comparison of total RNA purity and yield from Yew needles by 4 extraction methods (n=3)

方法Methods材料SpeciesA260A280A260/A280RNA浓度RNA concentration(μg/mL)产率Yield(μg/g·FW)TRIzol法TRIzol method幼嫩叶Young needles0.1187±0.0040.061±0.0021.78±0.42135.3±2.665.2±2.1CTAB法CTAB method成熟叶Mature needles0.212±0.00250.152±0.0031.39±0.01269.3±2.3127.2±1.5SDS酚法SDS phenol method成熟叶Mature needles0.14±0.00470.105±0.0761.33±0.02205.3±2.3140.0±4.7改良CTAB-LiCl法Modified CTAB-LiCl method成熟叶Mature needles0.219±0.0140.117±0.0091.88±0.03428.3±3.4174.9±10.8

3.3 提取红豆杉针叶RNA的特定基因的克隆

分别将TRIzol法和CTAB-LiCl法提取的红豆杉针叶RNA进行反转录，得到的cDNA片段大小在200～1500 bp范围内，符合常规的反转录结果(图3)。

以上述cDNA为模板，利用基因18S rRNA为引物进行PCR扩增，PCR产物凝胶电泳结果显示，18S rRNA在红豆杉幼嫩、成熟针叶中均扩增出与预期大小一致的片段，以成熟针叶为材料采用CTAB-LiCl法提取RNA，反转录后扩增条带清晰且特异性强(图4)。进一步将条带回收并测序，得到的序列在GenBank进行BLAST比对后确认为红豆杉的18S rRNA基因序列。说明改良的CTAB-LiCl法提取的红豆杉RNA，反转录结果好，可以应用于后续基因表达等分子生物学研究。

图3 红豆杉针叶RNA的反转录结果M: DNA marker; 1: 改良CTAB-LiCl法提取红豆杉成熟叶总RNA反转录cDNA， 2: TRIzol法提取红豆杉幼嫩叶总RNA的反转录cDNA， cDNA浓度: 1 (20 ng/5 μL), 2 (15 ng/5 μL)。Fig.3 Electrophoretogram of transcription of total RNA from needlesM, DNA marker, 1, Total RNA transcription from mature needles by CTAB-LiCl method extraction, 2, Total RNA transcription from young needles by TRIzol extraction. cDNA concentration: 1, 20 ng/5 μL; 2, 15 ng/5 μL.

图4 RNA反转录后进行18S rRNA基因扩增的结果M: DNA marker; 1: 阴性对照(水作为模版)，2: 幼嫩针叶扩增18S rRNA基因，3: 成熟针叶扩增18S rRNA基因。Fig.4 Electrophoretogram of 18S rRNA gene amplified with cDNA after RNA transcriptionM: DNA marker, 1: Negative control (RT-PCR amplification of water template), 2: RT-PCR amplification of 18S rRNA gene of young needles, 3: RT-PCR amplification of 18S rRNA gene of mature needles.

4 结 论

采用改进的CTAB-LiCl法能有效从红豆杉成熟针叶中提取纯度较高、完整性较好的RNA，A260/A280比值为1.9～2.0，28S、18S的电泳条带清晰,总RNA产率较其它方法高。本研究中建立的红豆杉成熟针叶RNA的提取方法为红豆杉等针叶植物分子生物学的研究奠定良好的技术基础，同时也对其它富含多糖多酚以及植物表皮蜡质结构较多的试验材料RNA提取具有很好的借鉴意义。