重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的质量分析及发展方向

杨劲松，吴涛，李金祥

（1中国兽医药品监察所，北京 100081；2中国农业科学院，北京 100081）

高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI），是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性传染病，可导致家禽、各种野鸟、特别是迁徙水禽的感染，是世界动物卫生组织（OIE）规定的必须报告的动物疫病[1]，我国将其列为一类动物疫病。1878年首次报道禽流感病毒（AIV）在意大利鸡群中暴发[2]，随后世界各地均有该病暴发和流行的报道，给养禽业带来了巨大的经济损失。l997年发生在我国香港的禽流感感染人事件，更加引起人们对该病的关注。2005年，H5N1亚型禽流感病毒引起野生鸟类的大规模死亡，并随野生鸟类的迁徙而传播到更广泛的区域[3]。十余年来，我国发现的H5亚型禽流感病毒多为H5N1亚型。但是近些年来，在我国H5N2、H5N8、H5N6、H5N5 等亚型显著增多[4-6]。

高致病性禽流感在我国暴发后，农业农村部采取免疫与扑杀相结合的防控措施,其中全面免疫是关键技术措施和突出特点[7]，因此在较短时间内就控制了禽流感疫情[8]。国家规定每年春秋两季进行集中强制免疫，使用的疫苗主要为重组禽流感病毒灭活疫苗。对于疫苗质量，国家高度重视，并对疫苗生产企业采取了严格的监管措施和市场准入制度，为禽流感的防控发挥了重要作用[9]。为了促进疫苗生产企业的技术进步，保障疫苗质量，对近年来重组禽流感灭活疫苗的质量情况进行了分析，并提出了禽流感疫苗的研制发展方向，以期为禽流感疫苗的生产和研制提供有益的帮助。

1 我国重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的种类和使用情况

2004年初我国首次批准使用了低致病性 H5N2亚型的禽流感病毒灭活疫苗（N28株），但由于H5N2亚型禽流感病毒的复制效率低，与国内流行株抗原匹配性差。2005年1月，又推出了针对第0分支的Re-1株疫苗。随着病毒抗原性的不断变异[10-11]，原有疫苗的保护效率下降，不足以对新出现的病毒或变异株提供足够的保护[12]。2007年至2008年3月，先后推出针对第7分支的 Re-4株疫苗和第2.3.4分支病毒的Re-5株疫苗[13]。2010年开始，第2.3.4分支的病毒开始出现较大变异[14-16]，导致Re-5株疫苗对其保护效果较差。2012年3月，我国推出了针对第2.3.2.1分支Re-6株疫苗[17]，替换原来的 Re-5株疫苗。2014 年4月，推出针对第7.2分支[18]的Re-7株疫苗，替换原来的 Re-4株疫苗，2016年至今我国未再分离到7.2分支病毒。2013年以来，多地暴发了由2.3.4新分支病毒引起的高致病性禽流感疫情，国际H5N1进化工作组将该变异株分支命名为第2.3.4.4分支[19]。2015年 11月，农业部批准了针对该分支病毒的 Re-8株疫苗，并于2016 年2月开始上市使用。目前，对于禽流感H5亚型病毒来说，2.3.4.4分支是在我国流行的主要分支，另有少量的新型 2.3.2.1分支病毒和野鸟型病毒。到目前为止，高致病性禽流感H5N1毒株共划分出 10 个进化支（0—9）[20]。禽流感 Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8 各疫苗株之间的血凝抑制抗原相关系数在 0.17—0.67 之间，表明不同分支之间的抗原性有较大差异[21]，因此必须使用匹配相应分支的疫苗才能取得理想的防控效果。

2 我国重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的生产现状

目前国内生产重组禽流感病毒 H5亚型灭活疫苗的生产企业共有10家，分别是哈尔滨维科生物技术开发公司、青岛易邦生物工程有限公司、肇庆大华农生物药品有限公司、乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂、辽宁益康生物股份有限公司、广东永顺生物制药股份有限公司、哈药集团生物疫苗有限公司、南京梅里亚动物保健有限公司、吉林冠界生物技术有限公司、山东信得动物疫苗有限公司。其中吉林冠界生物技术有限公司和山东信得动物疫苗有限公司采用悬浮细胞工艺生产，其余8个厂家均采用鸡胚工艺进行疫苗生产。

国内近三年来取得生产批准文号并已投入生产的重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗主要有：重组禽流感病毒 H5亚型灭活疫苗（Re-6株）、重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-6株+Re-7株）、重组禽流感病毒 H5亚型二价灭活疫苗（Re-6株+Re-8株）、重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）、重组禽流感病毒（H5亚型）二价灭活疫苗（细胞源，Re-6株+Re-8株）、重组禽流感病毒（H5亚型）三价灭活疫苗（细胞源，Re-6株+Re-7株+Re-8株）、重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）。根据禽流感病毒的流行趋势，2016年 4月至 2017年7月农业部规定将重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）作为主要的高致病性禽流感强制免疫疫苗[22]；2017年7月至今，农业部规定将重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）作为主要的高致病性禽流感强制免疫疫苗[23]。

近三年重组禽流感病毒灭活疫苗的批签发批数和总产量均呈明显上升趋势，2017年的总产量较 2015年增长了26.2%（表1）。

表1 2015—2017年重组禽流感病毒灭活疫苗产量统计Table 1 Production statistics of recombinant avian influenza virus inactivated vaccine from 2015 to 2017

3 我国对重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的质量监管

重组禽流感病毒灭活疫苗的质量监管由农业部兽医局主管，中国兽医药品监察所负责具体实施。为进一步加强疫苗质量监管，把对农业部定点生产企业进行兽药 GMP监督检查、实施产品的监督抽检和落实批签发制度作为三大有效的监管手段。此外，针对投诉、举报等情况，还要组织不定期的兽药 GMP飞行检查。

3.1 企业监督检查

中国兽医药品监察所每年组织春秋两季监督检查，实现对重组禽流感病毒灭活疫苗生产企业每年两次全覆盖检查。检查重点包括企业生产情况、GMP有效管理情况、疫苗生产和检验过程中的质量控制情况、生物安全管理情况等。2015年检查18家次，2016年检查18家次，2017年检查20家次。

3.2 产品监督抽检

不仅从企业成品库抽检，而且从产品流通、使用环节着手，加强对政府招标采购重大动物疫病疫苗的监管，并且逐年增加流通、使用环节的抽检数量。近三年共监督抽检重组禽流感H5亚型灭活疫苗130批次，合格率均为100%。

3.3 成品批签发制度

每批兽用生物制品在出厂前须经监管部门审查批准后，产品方可上市销售。中国兽医药品监察所调整了批签发环节工作方式，提高产品批签发执行标准，将兽药国家标准改为企业成品的内控质量标准，对提高产品质量取得了较好效果。2015年重组禽流感病毒灭活疫苗批签发批数为1 507批，2016年为1 715批，2017年为1 856批，签发率均为100%。由此看出重组禽流感病毒灭活疫苗的批签发批数呈明显上升趋势，2017年的批签发批数较 2015年增长了23.2%。

4 我国重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的质量分析

作为合格疫苗的评价标准，一定要做到安全、有效和质量可控。笔者根据企业上报的批签发报告情况，以2016年至2017年农业部规定的高致病性禽流感强制免疫疫苗重组禽流感病毒 H5亚型三价灭活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）为例，进行数据分析。随机选取了4家疫苗生产企业，分别为3家鸡胚生产工艺（简称为企业1、企业2、企业3）和1家悬浮细胞生产工艺（简称为企业 4），从疫苗的安全性和效力两方面对重组禽流感病毒 H5亚型灭活疫苗进行质量分析，为疫苗生产企业提供改进生产工艺、提升疫苗质量的建议。

4.1 疫苗的安全性分析

对4家企业在2016至2017年生产的488批次疫苗安全检验统计结果显示，所有批次均符合规定。这与现地反馈重组禽流感病毒灭活疫苗在免疫后一般无可见不良反应的说法相一致，但在局部地区偶有发生蛋鸡免疫后产蛋率下降的现象。经分析，造成此现象有两个方面原因。一是免疫过程对蛋鸡的应激会造成短时间的产蛋率下降，但此影响过程是短暂的。有报道指出，处于产蛋期的蛋鸡对应激因素敏感，对外界任何刺激都会表现出一定的应激反应，在接种后产蛋率一般都会出现 2—3周的下降[24]。因此，为了减少这种情况的发生，在产蛋高峰期接种的鸡群，可以在接种免疫前后各3 d，在饮水后饲料中添加电解多维、维生素C等抗应激剂，缓解和降低各种应激反应。同时，将疫苗恢复至室温，在傍晚注射也可降低应激反应。从疫苗本身讲，不排除疫苗中杂蛋白含量较高或甲醛、内毒素含量较高而引起的疫苗免疫副反应，可通过抗原纯化和降低内毒素含量等措施来减少疫苗副反应的发生。

4.2 疫苗的效力分析

对4家企业的488批次重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）的效力检验数据情况进行分析，其中2016年生产327批，2017年生产161批。检测方法均为血清学方法。

4.2.1 Re-6株、Re-7株、Re-8株不同组分效价的比较 435批鸡胚生产工艺疫苗Re-6株组分抗体效价的几何平均滴度（GMT）为8.7 log2；Re-7株组分抗体效价 GMT为 7.4 log2；Re-8株组分抗体效价GMT为8.7 log2。53批悬浮培养工艺疫苗Re-6株组分抗体效价GMT为8.3 log2；Re-7株组分抗体效价GMT为8.1 log2；Re-8株组分抗体效价GMT为8.2 log2。由此可以看出，所有批次疫苗抗体效价GMT至少高于国家标准（6 log2）1个滴度以上，而Re-6株和Re-8株组分抗体效价GMT至少高于国家标准2个滴度以上。对于鸡胚生产工艺疫苗而言，Re-6株和Re-8株组分抗体效价GMT基本一致，均高于Re-7株组分1个滴度以上，在生产工艺规程要求抗原配比为 1∶2∶1的情况下，说明 Re-6株和 Re-8株病毒的鸡胚适应性明显优于 Re-7株。而悬浮培养工艺疫苗的3个组分，抗原按生产工艺规程要求配比为1∶2∶1的情况下，抗体效价的几何平均滴度基本一致，说明 Re-7株的细胞适应性优于鸡胚适应性。鸡胚生产工艺疫苗3个组分中有2个组分抗体效价GMT高于悬浮培养工艺疫苗近0.5个滴度，加之生产工艺技术环节较悬浮培养工艺操作简单，因此是市场占有量远高于悬浮培养工艺疫苗的主要原因。

4.2.2 不同生产年份疫苗效价的比较 4家企业2016年共生产三价疫苗 327批，2017年共生产 161批。从不同组分抗体效价 GMT（图 1）可以看出，4个企业2017年生产疫苗的各组分抗体效价GMT均比2016年有所提高，说明生产工艺的不断成熟和优化，企业对产品质量的进一步严格把关。

4.2.3 不同生产企业间疫苗效价的比较 从 4家企业2016至2017年生产疫苗的不同组分抗体效价GMT（图 2）可以看出，产品的效价虽然都超过了国家标准，但质量水平还是参差不齐的，水平较高企业产品3个组分抗体效价的几何平均滴度比较低者要高出1.5个滴度以上。

4.2.4 同一疫苗生产企业不同批次疫苗批间差异的情况 从4家企业2016至2017年生产疫苗的3个组分抗体效价GMT的最高值和最低值（图3）可以看出各生产企业批间差异还是比较大，这虽有生产工艺不断成熟和优化的因素，但相近批次批间差异也会出现较大差异，说明了企业生产工艺并不十分稳定。究其原因，作为鸡胚工艺疫苗的重要生产原料低免胚（或非免胚）的质量批间差异较大；细胞工艺疫苗细胞的培养水平不稳定，呈现出同一批次产品 3个组分滴度水平较一致，但整体出现高低起伏的特点，可以用“一损俱损，一荣俱荣”来形容。

图1 不同生产年份不同组分疫苗抗体效价的比较Fig. 1 Antibody titer comparison of different components in different production year

5 我国禽流感病毒灭活疫苗生产工艺的改进及发展方向

5.1 生产工艺改进方向 好疫苗的评价标准，一定要安全性高、免疫效果好、副反应很小或无副反应。现有禽流感病毒 H5亚型灭活疫苗的安全性高，对同分支的禽流感流行毒株免疫效果好。灭活疫苗中含有的甲醛和细菌内毒素是造成疫苗副反应的直接原因，因此改进生产工艺，降低疫苗中甲醛和细菌内毒素的含量，可以降低疫苗的副反应。

图2 不同生产企业间疫苗效价的比较Fig. 2 Comparison of vaccine antibody titer from different manufacturers

图3 同一疫苗生产企业不同批次疫苗抗体效价批间差异的情况Fig. 3 Difference of antibody titer between different batch vaccines in the same manufacturer

5.1.1 离心纯化工艺 通过连续离心后过滤的方式去除收获尿囊液中的杂质（如蛋壳、卵黄液等）、杂蛋白以及降低污染细菌的数量。这样既可有效的降低灭活时甲醛的使用量，又可以降低细菌内毒素的含量。

5.1.2 浓缩纯化工艺 通过超滤浓缩设备及配套膜包进行抗原液的浓缩和甲醛的洗脱，可有效提高抗原含量和降低抗原液中的甲醛含量。

5.1.3 灭活剂的选择 甲醛是最传统的、应用最广泛的灭活剂，但也存在刺激性强、致癌危险、降低免疫原性、灭活效果受多种因素影响等缺陷。β-丙内酯（BPL）对病毒具有很强的灭活作用[25]，而且能在疫苗液体中完全水解，不必考虑在成品疫苗中的残留，接种反应也轻微。但与甲醛相比，BPL对细菌的灭活效果不理想且价格昂贵。盐酸聚六亚甲基胍（PHMG），具有使用浓度低、作用速度快，性质稳定，易溶于水的特点，常温下使用具有广谱高效、长期抑菌作用、毒性低和使用安全等优点，但 PHMG价格较贵，不易推广应用。二乙烯亚胺（BEI），具有不损伤病毒的抗原性和免疫原性的优点[26]，但对细菌的杀灭作用较弱且有诱导产生突变型病毒株可能。BEI现已成功地用于疫苗的生产，特别是由于其保存、毒性及成本等方面的优势而被广泛采用[27]。有研究表明，BEI在灭活流感病毒感染性的同时，能较好地保持病毒的抗原性[28]，并可减少疫苗的毒副作用，是开发研制禽流感病毒灭活疫苗的新型灭活剂。

5.2 禽流感疫苗的发展方向

就目前所研制的禽流感疫苗来看，鸡胚生产工艺的全病毒灭活疫苗占据主流市场。主要原因是鸡胚生产工艺繁殖病毒的含量高，对同分支的禽流感流行毒免疫效果良好，生产工艺技术相对简单，免疫持续时间较长等特点。但鸡胚作为疫苗的生产基质，存在受鸡胚来源、质量及自身不稳定性的影响，造成疫苗批间质量差异显著以及大规模生产时暴露性接种和收获增加了生物安全风险。而且由于鸡胚的大小不一，限制了自动化接种、收获，生产效率无法大幅度提高；鸡胚中杂蛋白还可能引起过敏反应。另外，大批量鸡胚的废弃鸡胚的处理也给企业及环境带来了沉重负担。

采用悬浮细胞工艺可进行大规模生产，缩短了生产周期，具有自动化控制程度高、批间差异相对较小和产品均一性程度高等优点。但目前免疫效果并不优于鸡胚工艺疫苗，而且由于疫苗中或多或少含有细胞碎片的原因，有可能带来一些副反应，这也是其没有能够占据主流市场的原因。如何进一步提高禽流感病毒在悬浮细胞的繁殖滴度，优化和提升生产工艺，是悬浮细胞工艺研究的发展方向。

目前研究的疫苗还有重组活载体疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、通用疫苗等。其中，重组活载体疫苗克服了灭活苗所存在的一些问题，可同时诱导体液免疫和细胞免疫[29]，但有母源抗体的家禽接种后效果并不理想且接种后不易通过监测抗体水平确认免疫效果。亚单位疫苗制作成本过高，免疫期短，不适于用作生产用疫苗，只能作为一种实验室研究手段。核酸疫苗是当前禽流感疫苗研究的前沿技术，其抗原合成和提呈过程与病原的自然感染相似，可同时诱导体液免疫和细胞免疫，具有其他疫苗所不具备的优点，是现阶段禽流感疫苗硏制中最具理想前景的疫苗，也是禽流感疫苗研究的一大热点。

在防控禽流感的过程中，最大的难题来自抗原漂移。由于频繁的抗原漂移，使得常规疫苗常常需要不断更新毒株才能维持保护力，这给实际生产带来很多不便。具有交叉保护性的广谱免疫原性的通用疫苗可以有效的解决这一难题[30]，是现阶段流感疫苗研究的一个重要研究方向。