超声-微波协同萃取法提取桑叶γ-氨基丁酸的工艺研究

钟杨生，陈恒文，陈芳艳，林健荣

（华南农业大学动物科学学院，广东 广州 510642）

桑叶为桑科植物桑树（Morus albaL.）的叶子。据《神农本草》记载，桑叶味苦、甘，能够疏散风热、清肝明目、清肺润燥，具有降血糖、降血脂、抗衰老等作用。通过近代药理学的研究和分析发现桑叶中的功效成分有黄酮、多糖、生物碱等活性物质［1-3］。本课题组在开展桑叶活性物质的研究时发现，抗青10号、云阳、大红皮等品种的桑叶富含γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA)，尤其在桑嫩芽中含量更高［4-6］。GABA是哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质，具有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、促进乙醇代谢（醒酒）等多种功效［7-10］。2009年卫生部已正式批准GABA为新资源食品，随着人们对GABA研究的不断深入，GABA作为新型功能因子逐渐被运用于食品、饲料、医药及化妆品等领域［11-12］。桑树在我国种植范围广、产量高、生产成本低、资源丰富，对桑叶GABA进行研究并加以开发利用，具有重要的科学价值和广阔的市场前景。

依据GABA水溶性的特点，通常以水为溶剂提取，但传统的提取方法提取时间长、提取效率低［15］。微波辅助萃取法相对于传统方法可缩短提取时间、提高提取效率、降低能耗［16-18］。超声-微波协同萃取技术则是将超声波和微波结合在一起的新技术。超声波利用在溶剂和样品间产生的声波空化作用，可增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物溶出速度和溶出量。微波的电场能够引起分子运动，极性分子在微波电磁场的作用下，产生瞬间极化，从而产生键的振动、撕裂和粒子之间的相互摩擦、碰撞，使分子极性部分更好地接触和反应，同时迅速生成大量热能。物质吸收微波能，细胞内部温度迅速上升，压力超过细胞壁膨胀承受能力，使细胞破裂，细胞内有效成分自由流出，从而有利于细胞中物质的提取［19-22］。钟杨生等［15-16］报道了用传统提取法和微波辅助萃取法萃取桑叶GABA的工艺，但目前尚未见用超声-微波协同萃取法提取桑叶GABA 的报道。本文采用超声-微波协同萃取法提取桑叶GABA，可为下一步开展桑叶GABA活性功能研究打下基础，为桑叶的进一步开发利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗青10号桑叶由华南农业大学动物科学学院提供。桑叶经水洗后60℃干燥粉碎过630 μm筛，用甲醇去色素后干燥，置于4℃条件下冷藏备用；γ-氨基丁酸（GABA）标准品购自美国Sigma公司；次氯酸钠、重蒸酚、氢氧化钾、无水乙醇、三氯化镧、碳酸钠、碳酸氢钠等均为分析纯试剂。

CW-2000型超声-微波协同萃取仪为上海新拓微波溶样测试技术有限公司产品，微波功率10～800 W，微波频率2 450 MHz，超声波功率50 W，超声波频率40 KHz；UV-1700紫外分光光度计为日本岛津仪器（苏州）有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 GABA含量测定 参照文献［4，23］的方法进行不同浓度GABA标准液配制，在645 nm波长下测定吸光值，根据测得的吸光值以及相对应的GABA含量制作标准曲线。根据标准曲线制作方法得到回归方程y=0.6827x+0.0249（R2=0.9923），表明 GABA浓度与吸光度具有良好的线性关系。取适量样品提取液按标准曲线制作方法测定吸光度，通过标准曲线计算样品每克干桑叶中GABA的含量。

1.2.2 料液比对GABA提取量的影响 准确称取2 g桑叶6份，分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL)加入蒸馏水，在微波功率100 W、超声波功率50 W的条件下提取2 min，提取次数为1次，测定GABA含量。

1.2.3 微波功率对GABA提取量的影响 准确称取2 g桑叶8份，固定料液比1∶20，提取2 min，提取1次，超声波功率50 W(超声波功率固定，不可调)，调节微波功率为50、100、150、200、250、300、350、400 W，测定GABA含量。

1.2.4 提取时间对GABA提取量的影响 准确称取2 g桑叶6份，固定微波功率100 W、超声波功率50 W、料液比1∶20加水，提取1次，分别提取1、2、3、4、5、6 min，测定GABA含量。

1.2.5 提取次数对GABA提取量的影响 准确称取2 g桑叶3份，固定微波功率100 W，超声波功率50 W、料液比1∶20加水、提取2 min，分别提取1、2、3次，测定GABA含量。

1.2.6 Box-Behnken响应面试验优化 在单因素实验的基础上，每个因素选取3个对GABA提取量影响较大的水平，建立3因素3水平的Box-Behnken中心试验，以GABA提取量为响应值，各因素3水平采用-1、0、1进行编码（表1）。

表1 Box-Behnke试验水平和编码

采用Design-Expert V8.0.6 软件对试验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素对GABA提取效果的影响

2.1.1 料液比对桑叶GABA提取量的影响 从图1可以看出，GABA提取量随着料液比的增加而增加，当料液比增大到1∶40时，继续增大料液比提取率变化不大。从提取效率以及产品后加工的浓缩处理工序考虑，选择最适宜的料液比为1∶40。

图1 料液比对桑叶GABA提取量的影响

2.1.2 微波功率对桑叶GABA提取量的影响 在料液比为1∶40条件下，研究微波功率对提取效率的影响，结果见图2。GABA的提取量随着微波功率的增大而增加，在150 W时提取量达最大值，之后GABA提取量随着微波功率增加反而略有降低。可能是由于在低功率时分子运动不剧烈，破细胞效果不明显，故GABA浸出率不高；随着微波功率的不断增加，分子运动加剧，有利于GABA的溶出；而当微波功率进一步加强时，其强热效应可对GABA产生破坏而减少，造成提取率下降；另外微波功率过高容易产生爆沸现象。因此，选择150 W为最佳提取功率。

图2 微波功率对桑叶GABA提取量的影响

2.1.3 提取时间对桑叶GABA提取量的影响 由图3可知，提取时间在3 min时GABA提取量最大，之后随着提取时间延长，其提取效率增加并不明显。可能因为超声、微波处理能使细胞在短时间内迅速破裂，GABA快速溶出，使溶质迅速达到固液平衡，因此延长时间效果不理想。因此，选择最佳微波处理时间为3 min。

图3 提取时间对桑叶GABA提取量的影响

2.1.4 提取次数对桑叶GABA提取量的影响在上述最佳提取条件下，考察提取次数对桑叶GABA提取量的影响。连续提取3次，第1次提取量是总提取量的91%、第2次为5%、第3次为4%。尽管总提取量随着提取次数的增加而增加，但是第2次和第3次增加的幅度都很小，因此，选择提取1次。如果有连续提取设备，可采用逆流提取提高效率。

2.2 超声-微波协同萃取法的Box-Behnken试验

在单因素试验的基础上，对影响桑叶GABA提取量最为密切的料液比、微波功率和提取时间这3个因子进行Box-Behnken组合设计，结果见表2。根据表2结果计算各项回归系数，以这些回归系数建立桑叶GABA提取量与料液比（X1）、微波功率（X2）和提取时间（X3）3个因子的回归方程：

方差分析显著性检验结果（表3）表明，该模型与试验拟合较好，回归方程R2=0.9916，自变量与响应值线性关系显著，可以用于桑叶GABA超声-微波辅助提取试验的理论预测。在P=0.05显著水平剔除不显著项，得到优化方程为：

表2 Box-Behnken试验设计及实验结果

从回归系数的显著性检验可以看出，微波功率（X2）与提取时间（X3）的互作效应对桑叶GABA提取量影响明显，从响应面图（图4）可知，在所设计的实验条件范围内，微波功率和提取时间都可增加桑叶GABA提取率，二者交互作用表现为桑叶GABA提取量增大。

采用贡献率法对各因素的重要性分析可知，料液比、微波功率和提取时间对提取率的贡献率分别为2.4158、2.3669和2.4365，对桑叶GABA提取量作用大小依次为提取时间＞料液比＞微波功率。微波处理时间长短对提取量的影响最大，可能是因为微波穿透能力极强，直接作用于桑叶细胞内部，使有效成分很快溶出，同时可使溶剂温度升高较快，有利于有效成分的提取。

表3 回归模型及方差分析

图4 微波功率和提取时间对GABA提取量的交互作用

通过SAS响应面分析，并结合数学模型，超声-微波协同提取桑叶GABA的最优参数为：料液比1∶34，微波功率为144 W，提取时间为165 s。在此工艺条件下桑叶GABA提取的理论值为5.77 mg/g。采用上述最优条件进行GABA提取，结果实际得到桑叶GABA的提取量为5.83 mg/g，与理论值相比相对误差很小。

3 结语

本试验选用超声-微波协同萃取法提取桑叶GABA，以蒸馏水为溶剂，研究超声波-微波的功率、料液比及提取时间对提取率的影响。在单因素试验结果的基础上，运用Box-Behnken旋转组合设计试验，确定了最适的提取工艺，并按最佳工艺进行了验证试验，优选出超声-微波协同提取桑叶GABA的最优参数为：料液比1∶34，超声波功率为50 W，微波功率为144 W，处理时间为165 s，提取1次。在此工艺条件下提取量为5.83 g/mg。各影响因素贡献率表现为提取时间＞料液比＞微波功率。

采用超声-微波协同萃取法提取桑叶γ-氨基丁酸（GABA）提取率高、提取时间短，抗青10号的桑叶GABA提取量为5.83 mg/g，提取时间为165 s；传统水提取法提取桑叶GABA,提取时间为 2.13 h，在同一品种同一测定方法条件下桑叶GABA提取量为 4.64 mg/g［15］；而微波辅助萃取法处理时间为 11.69 min，提取量为5.83 mg/g［16］。可见，采用超声-微波萃取法可显著提高生产效率。