液相色谱—质谱联用技术与代谢组学

李亚港

摘 要：色谱联用技术是将色谱分离装置与各种检测装置通过接口技术连接后而成的一种新型的仪器分析技术。液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）由于能够分离极性的、离子化的、不易挥发的和热不稳定的化合物，具有更广阔的应用前景。色谱-质谱联用技术是代谢组学的主要分析技术平台，随着LC/MS技术的不断发展，必将会更多地应用于代谢组学方面，为其分析提供更多的方法与方便。本文从当前代谢组学研究平台技术的角度，系统地介绍液质联用方法的基本原理与代谢组学的关系。

关键词：LC/MS；代谢组学；药物分析

一、液质联用技术的原理

（1）LC色谱单元部分

①液-固色谱法。液-固色谱法是使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5～10um。适用于分离分子量为200～1000的非离子型化合物，因此这种色谱法常用于分离同分异构体。

②液-液色谱法。液-液色谱法是一种基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离的方法。按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC）。一般的分离方法都是反相色谱法。

③离子交换色谱法。离子交换色谱法的固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面末端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

④离子对色谱法。又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而改善分离效果。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

⑤排阻色谱法。排阻色谱法的固定相是有一定孔径的多孔性填料，利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等高分子化合物。

（2）质谱单元部分

质谱分析的原理是先将待测化合物的分子离子化，然后在电场和磁场共同的作用下，将所得到的不同质荷比的分子离子和碎片离子进行分离，从而能够得到一组特征质谱图，由于质谱分析特征性强、重现性好，所以作为未知组分分析的一个有效手段和工具，经常被用于定性分析。

小型质谱仪的质谱检测器（MSD）是最早被用于与GC联用的，而MSD与LC的联用则是在后才成熟和发展起来的。

（3）连接部分

由于液相色谱的流动相流速较大，而质谱需要在真空的环境下工作，因此两者如何连接成为LC/MS技术的关键。目前的LC/MS接口主要有移动带（MB）、直接液体引入（DLI）、热喷雾（TSP）、快原子碰撞（FAB）、颗粒束（PB）、大气压（API）接口等。使用最广的接口设备是大气压接口。

二、常用液相色谱-质谱仪介绍

常用的4種LC/MS包括超高压液相色谱-四极杆质谱仪（UPLC/Q-MS）、液相色谱-四极杆-离子阱串联质谱仪（LC/Q-Trap-MS-MS）、常规高效液相色谱-四极杆质谱仪（LC/Q-MS）、超高压液相色谱-四极杆-时间飞行串联质谱仪（UPLC/Q-TOF-MS-MS）。

（1）液相系统（LC系统）。

LC系统包括常规的LC和UPLC。UPLC在HPLC的基础上发展而来，它涵盖了小颗粒填料，非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量，灵敏度及色谱峰的容量。与传统的HPLC相比，UPLC具有以下优点。

①超高分离度。UPLC用1.7μm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰，从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。而且又最大地缩短了开发方法所需的时间。

②超高速度。UPLC系统在HPLC系统3倍的流速下进行而保持柱效不变。其快速分析亦节省了以往一向耗时的方法验证的时间，使方法验证变得简单快速。

③超高灵敏度。UPLC使用小颗粒技术可以得到更高的柱效、更窄的色谱峰宽，即更高的灵敏度。同样，当UPLC用于快速分析、用较短色谱柱而使柱效不变时，色谱峰高会相应增加。因此，使用UPLC技术，不仅可以在保持与HPLC相同分离度时提高峰高，而且在改善分离度的同时亦可提高峰高即灵敏度。

（2）质谱系统（MS系统）

构成MS系统的5个基本部分的组成是相同的，即接口，离子源，真空系统，检测系统及数据处理系统。

①电离源。在液质联用的发展过程中，出现了各种电离源，主要有电喷雾电离源（ES），大气压化学电离源（APCI）和大气压光化学电离源（APPID）。

②真空系统。真空系统中包括了离子透镜，质量分析器和检测器3个主要部分。不同的离子源在不同的设计中一般都是有2～3个不同的真空区，并由附加的机械泵抽气形成。

③质量分析器。质量分析器是LC/MS组合分类中主要的标准之一。质量分析器是依据不同方式将离子源中生成的样品离子按质荷比m/z的大小分开的仪器，是质谱仪的重要组成部件，位于离子源和检测器之间[1]。常用的质量分析器有：单聚焦质量分析器、双聚焦质量分析器、四级杆质量分析器、飞行时间质量分析器、离子册质量分析器，以及离子回旋共振质量分析器等，而与LC系统进行相连的质量分析器主要是：四级杆、离子阱、飞行时间及傅立叶变换。

三、液质联用技术在代谢组学中的应用

代谢组学（metabonomics/metabolomics）是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想[2]，对生物体内所有代谢物进行定量分析，寻找代谢物与病理生理变化关系的研究方式。研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质[3，4]。代谢组学分析方法要求具有高灵敏度、高通量和无偏向性的特点，因此单一的分离、分析技术难以满足这一要求。因此，越来越多的分离、分析手段及其组合出现在代谢组学的研究中[5]。从总体而言，由于LC/MS较高的灵敏度和较宽的动态范围，其已被越来越多地应用于代谢组学研究。

HPLC是代谢组学研究的重要工具，可靠的HPLC技术将在代谢组学研究中发挥不可替代的作用。目前的研究已证明基于HPLC的代谢组学有良好的前景。高分辨HPLC/MS-MS系统的广泛可靠性在获得代谢指纹谱的分析方法逐渐成为重要的手段[6]。

参考文献

[1]邱永红.质量分析器新理论初探[J].分析仪器，2014（3）：81-87.

[2]Nicholson J K，Wilson I D.Nat.Rev.Drug Discovery，2003，2（8）：668-676.

[3]贾伟，敖平，王晓艳.科学，2012，64（6）：12-15.

[4]邹忠杰，袁经权，龚梦鹃，沈志滨.广东药学院学报，2009，25（4）：424-428.

[5]许彬，王海龙，等。代谢组学分析技术及其在几类重大疾病研究中的应用[U].分析测试学报，2006，25（5）：128-132

[6]贾伟.医学代谢组学[M].上海：上海科学技术出版社，2011：193-218.

（作者单位：郑州大学）