Fmr1基因敲除小鼠的三箱社交新奇偏好行为观察

陈 锡 陈楚茂 许宏烽 罗朝文 冯嘉欣 李秋霞 柯思楷 陈盛强 邓小燕

在社会上,人们通过传递信息、交流思想，以达到某种目的的各种活动，就是社会交往，简称社交。人行为的产生是极其复杂的过程，由于内外环境的变化作用于相应的感觉器官，导致个体对这种变化产生相应的行为[1]，这是社交行为产生的机制。人们在社会中通过彼此间的社交，能让自己融入这个社会。对于许多动物来说，社交同样重要。社交行为障碍是许多精神疾病的重要特征，例如自闭症、抑郁症和精神分裂症等。因此，社交行为的变化就成了判断许多精神疾病的标准之一。为了在动物模型上研究社交行为的变化，人们开发出了许多行为学实验，其中包括较为成熟的针对小鼠的“三箱社交行为实验”。三箱社交行为通过分析主要反映小鼠的社交新奇偏好，其原理是基于小鼠对新物件具有探索倾向的特性。可通过小鼠在实验第二阶段的三箱各区域的活动水平来反映其社交行为。

脆性 X 综合征(Fragile X Syndrome, Fra(X)S)属于 X 连锁不完全显性遗传病, 该病是由 X 染色体上的 FMR1基因改变引起 FMR蛋白表达异常造成的[2]。临床表现主要为不同程度的认知功能损害，精神行为异常，青春期后出现巨睾丸，部分患者可出现长脸、招风耳、高腭弓等面部特点及孤独症样的行为特征[3]。目前国内对脆性 X 综合征小鼠的社交新奇偏好的研究较少。本研究对正常小鼠的FMR1基因进行敲除建立脆性X综合征的小鼠模型，采用三箱的方法对6 周龄 Fmr1 基因敲除小鼠及野生型小鼠的社交新奇偏好进行分析，旨在探讨脆性 X 综合征小鼠是否有社交新奇偏好。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级FVB近交系小鼠来自荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心 Ostra BA 教授的赠送，包括Fmr1 基因野生型( WT) 纯合子及其敲除型( KO) 纯合子，于广州医科大学实验动物中心饲养。选用的实验动物分为6周龄 KO 和 WT 组，每组15 只，共两组，体质量15～17 g；同时准备不同笼6周龄KO和WT组，每组两只，共两组, 体质量15～17 g。三箱实验于广州医科大学附属第二医院动物行为学实验室操作。所有实验动物的饲养和操作均遵循3R原则。

1.1.2 主要设备与仪器 该三箱系统主要由三个矩形舱室、长方体容器、视频分析系统组成。每个矩形舱室规格为20 cm×40 cm×23 cm，中间有通道使三箱相通，通道规格为6 cm×6 cm; 长方体容器高17 cm，底部边长为7.2 cm；摄像头安放于三箱上方2 m高度。 按左中右将三个矩形舱室平均划分为3个象限，在左上和右下各划分一个边长7.2 cm的正方形象限。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物基因型的鉴定 实验动物基因型的鉴定参考相关文献[4]。

1.2.2 三箱实验条件设置 三箱视频分析系统参数选择为白鼠黑色背景，二值化处理的阈值设定为20。实验在安静的实验室内进行，每次实验时光源等保持不变。

1.2.3 三箱实验(Three-chamber Test) 三箱含有三个舱室，在左右舱室里各放一个空金属笼子，将测试小鼠(KO/WT)沿中间舱室侧壁放入三箱内，让其适应10 min。实验第一阶段，将测试小鼠(KO/WT)取出，在左侧舱室里的金属笼子里，放入一个球状物，在右侧舱室里的金属笼子里，放入一只同笼同性别小鼠；将测试小鼠(KO/WT)沿中间舱室侧壁放入三箱内，让测试小鼠(KO/WT)在三个舱室中自由活动10 min。实验第二阶段，将测试小鼠(KO/WT)取出，有球状物的金属笼子中，用一只不同笼同性别小鼠取代球状物，将测试小鼠(KO/WT)沿中间舱室侧壁放入三箱内，使测试小鼠(KO/WT)在三个舱室中自由活动，同时使用摄像头跟踪小鼠运动轨迹并用SMART软件记录下相关参数：测试小鼠与金属笼接触的次数和时间(金属笼周围4.0 cm定义为接触范围)，记录10 min。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠鉴定结果

KO和WT小鼠基因PCR扩增后的电泳结果见图1。

2.2 小鼠第二阶段轨迹图

见图2、图3。

2.3 三箱实验

本实验分析了实验小鼠在第二阶段分别与熟悉小鼠、陌生小鼠接触的次数和时间，以了解其在三箱中的社交新奇偏好。分析结果发现，相比于WT组，在第二阶段KO组与陌生小鼠接触的次数和时间显著减少，P<0.05。见表1、图4、图5。

表1 Fmr1基因敲除小鼠三箱的实验数据分析 (n=15,n)

注：n熟表示第二阶段与熟悉小鼠接触的次数；t熟表示第二阶段与熟悉小鼠接触的时间(s)；n陌表示第二阶段与陌生小鼠接触的次数；t陌表示第二阶段与陌生小鼠接触的时间(s)

实验第二阶段，WT小鼠和KO小鼠分别跟陌生小鼠与熟悉小鼠接触时间比较。与 WT小鼠相比，KO小鼠与陌生小鼠接触时间明显减少，P<0.05。见图4。

图4 Fmr1基因敲除小鼠三箱实验第二阶段的接触时间分析

实验第二阶段，WT小鼠和KO小鼠分别跟陌生小鼠与熟悉小鼠接触次数比较。与 WT小鼠相比，KO小鼠与陌生小鼠接触次数明显减少，P<0.05。见图5。

图5 Fmr1基因敲除小鼠三箱实验第二阶段的接触次数分析

3 讨论

社会行为包括社会性决策、社会性记忆、社会性信息加工等[5]。社交新奇偏好属于社会行为的一种。本实验通过对KO和WT小鼠三箱行为进行分析，发现KO小鼠在实验第二阶段与陌生小鼠接触的时间、次数比WT小鼠明显减少，差异有统计学差异，表明与WT小鼠相比，KO小鼠没有社交新奇偏好，与Oksana KB等[6]的研究结果一样。对于WT小鼠有社交新奇偏好，而KO小鼠没有社交新奇偏好的原因，可能是由于野生型小鼠是群居动物，它们具有一定的社会属性，当它们在与同类相互接触后，能形成一定的社会记忆，而这一社会记忆能进一步影响它们的社会决断。所以当面对新奇陌生个体时，正常小鼠会回忆起之前接触并熟悉的同类的记忆。对它们而言，新奇的同类更具有诱惑性，因此，在同时面对熟悉和完全陌生的同类时，正常小鼠总是愿意与陌生个体接触更长的时间，表现出社交新奇偏好；而KO小鼠之所以没有社交新奇偏好，可能是由于其Fmr1基因被敲除，导致神经系统发育障碍，对新奇事物探索的欲望下降，引起社交新奇偏好散失。

虽然三箱社交测试存在耗时长(一次实验需要40 min左右)的缺点，但这几年随着三箱社交测试的发展与运用，三箱社交测试已经被证明可以提供标准化的操作流程，而且操作简单，是比较动物社交新奇偏好的较好方法；三箱社交测试正越来越频繁地被用作社交新奇偏好的指标[7-10]。本实验通过三箱社交测试结合计算机的采集和分析技术，记录FMR1基因敲除小鼠及野生型小鼠活动的全过程，并分析其运动轨迹，得到了相关行为学指标，发现脆性X综合征小鼠没有社交新奇偏好，提示脆性X综合征患者可能没有社交新奇偏好。