葡萄叶片表皮气孔与霜霉病的抗性研究

杜蕙 蒋晶晶 王春明 郭建国 漆永红

摘要：采用室内离体接种结合田间自然发病调查，研究了8个葡萄品种对霜霉病的抗性，结果表明，不同品种对葡萄霜霉病的抗性差异较大，高妻、夏黑、醉人香及矢富罗莎对霜霉病表现抗病（R），奥古斯特、红地球及贵妃玫瑰对霜霉病表现感病（S），瑞比尔表现高感（HS）。对8个葡萄品种的叶片表皮气孔观察表明，不同品种叶片气孔大小、密度不同。气孔密度由大到小依次为奥古斯特、矢富罗莎、夏黑、贵妃玫瑰、高妻、醉人香、红地球、瑞必尔。气孔的开张面积从大到小依次为醉人香、高妻、贵妃玫瑰、红地球、夏黑、奥古斯特、瑞必尔、矢富罗莎。各品种叶片气孔的密度及大小与霜霉病的抗性未表现出一定规律。

关键词：葡萄;叶片表皮气孔;霜霉病;抗性

中图分类号：S436.631.1        文献标志码：A       文章编号：1001-1463（2018）12-0058-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.12.017

葡萄霜霉病是由葡萄生單轴霉菌[Plasmopara.viticola]引起的葡萄生产上最重要的病害之一，世界各地葡萄产区均有发生，是一种世界性病害[1 - 2 ]。我国1899 年发现该病危害[3 ]，目前几乎所有葡萄产区都有发生，潮湿多雨地区危害更为严重，发病严重时严重影响树势和果实品质[4 ]。目前关于葡萄霜霉病的抗性研究主要集中在品种抗病性鉴定、病菌致病性分化及抗药性等方面 [5 - 9 ]，有学者对与抗性有关的葡萄叶片组织结构进行了研    究[10 - 13 ]，但不同学者的研究结果不同。我们以生产中主栽的鲜食葡萄品种为材料，观察了不同葡萄品种对霜霉病的抗性及叶片表皮的气孔，以期丰富葡萄霜霉病抗性机理研究。

1   材料和方法

1.1   试验材料

植物材料为葡萄室内盆栽苗，品种有：红地球、夏黑、高妻、瑞必尔、醉人香、贵妃玫瑰、奥古斯特、矢富罗莎。普通型塑料透明胶带，宽度为 18 mm，厚度为0.05 mm。

供试葡萄品种于2013年秋季扦插于甘肃省农业科学院植物保护研究所温室中。2014年8月从田间采集新鲜的葡萄霜霉病的叶片，用自来水反复冲洗掉老孢子囊后，在20 ℃条件下黑暗保湿培养24～48 h。待新孢子囊长出后用毛笔刷下，用无菌水配制成浓度为1×105～1×106个/mL孢子囊悬浮液备用。

1.2   试验方法

1.2.1    供试品种对霜霉病的抗性评价    采用室内离体叶片法结合田间自然发病调查进行品种抗性评价。室内离体叶片测定时，分别采集供测试葡萄品种新梢大小和叶龄基本一致的健康叶片，将事先准备好的孢子囊悬浮液用喉头喷雾器在叶片背面均匀喷洒10 mL，然后将叶片正面朝下放在铺有四层无菌水浸湿灭菌纱布的瓷盘中，为避免叶片与湿纱布接触腐烂，在叶片下放置玻璃棒，叶柄用脱脂棉保湿，磁盘用保鲜膜覆盖密封，于20 ℃条件下黑暗保湿培养。以喷等量清水为对照，每品种接种10片叶，重复3次。逐日观察记录发病情况，用接种后第7天的调查数据计算病情指数。

田间自然发病调查参考刘天明等[13 ]的方法。2014年，在甘肃省农业科学院林果花卉研究所葡萄园分别在霜霉病初发期（7月5日）、盛发期（8月16日）及发病后期（9月22日）共进行3次调查。每品种选取20个新发的枝条，每枝自上而下调查10个叶位相同叶片，记录发病情况，计算平均病情指数。室内及田间病害调查分级方法按0级，无病斑;1级，病斑面积占叶面积5%以下;3级，病斑面积占叶面积6%～25%;5级，病斑面积占叶面积26%～50%;7级，病斑面积占叶面积     51%～75%;9级，病斑面积占叶面积76%以上进行。品种抗性评价参考刘新秀等[14 ]的5级分级法，即免疫（I），病情指数为0;高抗（HR），病情指数为0.1～5.0;抗病（R），病情指数为5.1～25.0;感病（S），病情指数为25.0～50.0;高感（HS），病情指数为50.0～100.0。

1.2.2    不同葡萄品种叶片表皮气孔压片制作     采用透明胶带粘取法[15 ]。塑料透明胶带拉开10～15 cm，胶面朝上，平放在实验台面上。带叶柄剪取葡萄叶片（第3～5片新叶），用水轻轻冲洗后用滤纸迅速吸干表面水分。左手捏住叶柄，将叶片正面粘在胶带上。在粘贴过程中，先将叶尖粘贴在胶带上，然后将叶片向叶背面弯曲逐渐向前推移，使叶片正面与胶带充分接触。为了防止粘贴过程中叶片皱缩，应右手持解剖针，置于叶片与胶带之间进行调整，使叶片平整地粘贴在胶带上。然后剪去叶柄。将胶带对折过来平整地粘贴在叶片的背面。然后用手指对捏胶带，使胶带与叶片两面充分粘着。将对折的胶带撕开，叶片正面仍紧密粘贴在胶带上，叶片背面与胶带分离，并将叶片下表皮粘贴在胶带上。若叶面附着物较多，胶带不能与表皮紧密粘着时，可用胶带连续重复粘贴叶片，直到粘去附着物后，粘取下表皮。为了防止粘取的表皮材料相互重叠，在连续重复粘贴时应更换胶带新的部位粘着表皮。

将带叶片下表皮的胶带沿表皮轮廓剪成 3～5 mm × 3～5 mm 的矩形片。在载玻片上滴1滴蒸馏水、1滴 1% 的碘-碘化钾染液，将带叶片表皮的胶带胶面向下置载玻片上染色 0.5～1.0 min，盖上盖玻片，压平后即制成气孔压片。

1.2.3    不同葡萄品种叶片表皮气孔测定    将制好的气孔压片在40倍光学显微镜下观察，每品种分别观察5张制片，分别量取50个气孔的纵径、横径，求其平均值。

气孔数目测定：在显微镜下数得每1视野中气孔的数目，计算10个视野的平均值。

气孔开张面积计算：S=纵径×横径× 3.14 × 0.25（单位μm2）。

气孔密度计算：气孔数/mm2 =视野气孔数/视野面积。

视野面积计算：S=πr2（r为视野半径）。

1.3   数据分析

试验数据用EXCEL2003进行统计分析。

2   结果与分析

2.1   不同葡萄品种对霜霉病的抗性

通过室内离体接种结合田间自然发病调查，供试品种对葡萄霜霉病的抗性评价结果见表1，高妻、夏黑、醉人香及矢富罗莎对霜霉病表现抗病（R），奥古斯特、红地球及贵妃玫瑰对霜霉病表现感病（S），瑞比尔表现高感（HS）。各品种在室内接种条件下病情指数均高于田间自然发病的病情指数，可室内离体接种所提供的环境条件更有利于霜霉病的发生。

2.2   不同葡萄品种叶片表皮气孔观察

通过对不同品种葡萄叶片表皮气孔压片的观察，发现葡萄叶片表皮有大量气孔存在。8个品种气孔密度在55～99个/mm2，不同品种叶表皮气孔数量差异较大。单位面积气孔数量由多到少的顺序为奥古斯特、矢富罗莎、夏黑、贵妃玫瑰、高妻、醉人香、红地球、瑞必尔。气孔的开张面积从大到小的顺序为醉人香、高妻、贵妃玫瑰、红地球、夏黑、奥古斯特、瑞必尔、矢富罗莎。

3   结论与讨论

通过室内离体接种结合田间自然发病调查，8个葡萄品种对霜霉病的抗性不同。高妻、夏黑、醉人香及矢富罗莎对霜霉病表现抗病，奥古斯特、红地球及贵妃玫瑰对霜霉病表现感病，瑞比尔表现高感。对不同品种葡萄叶片表皮气孔观察表明，奥古斯特叶表皮气孔密度最大，其次为矢富罗莎、夏黑、高妻、贵妃玫瑰、醉人香、红地球及瑞比尔。从气孔的大小看，醉人香气孔最大，其次为高妻、贵妃玫瑰、红地球、夏黑、奥古斯特、瑞必尔及矢富罗莎。

植物的一些结构特征，如角质层、气孔、叶片茸毛等均对病原物的侵入表现出一定的抗性。关于气孔在抗霜霉病中的作用， 不同学者有不同看法。王国英[11 ]的研究认为葡萄对霜霉病的杭性与叶片气孔的密度有极显著的关系。感病类型叶片气孔密而大，抗病类型叶片气孔少，且气孔周围有白色堆积物。一旦病菌从气孔侵入后，很快会产生孢囊梗和孢子囊，气孔就不能再关闭，从而不仅夺取寄主的营养，还会使蒸腾作用明显增强，这与吉丽丽[10 ]的研究结果一致。但刘天明[13 ]等认为气孔大小、密度及昼夜开闭程度与葡萄抗感病性无关，且气孔密度、气孔横径、气孔纵径与病级间也无显著相关性。Boubals D. [16 ]认为，气孔在抗病性中的作用很小，但气孔保卫细胞死亡会导致游动孢子萌发管以及菌丝体的死亡。关于气孔大小的划分界限，不同研究者有不同的标准。 我们将保卫细胞纵径大于30 μm的定为大气孔，15～30 μm的定为普通气孔，小于15 μm者为小气孔。据此，8个品种中只有瑞比尔和矢富罗莎的气孔属于小气孔，其他6个品种的气孔均属于普通气孔，且透明胶带粘取法观察植物气孔的方法操作简单、方便，能较好地反映气孔的大小。

本试验表明，气孔的密度及大小与霜霉病的抗性无直接关系。如较抗霜霉病的品种高妻，其气孔大小、气孔密度均高于高感霜霉病的品种瑞比尔，其他品种对霜霉病的抗性与其气孔大小及密度间也无规律可循。李华[12 ]认为叶片气孔对游动孢子向性引力大小，也是构成葡萄对霜霉病抗性的主要因素。抗病品种叶片上可侵入的孢子数目显著低于感病品种， 而感病品种叶片的气孔比抗病品种对游动孢子有更大的向性引力。葡萄对霜霉病的组织结构抗性是多种多样的，气孔仅为葡萄霜霉病菌进入叶片组织的通道。本研究仅对8个葡萄品种进行了研究，探究气孔与葡萄对霜霉病抗性的关系还需进行更多品种、更深入的研究。

参考文献：

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[11] 王国英.  葡萄叶片气孔与霜霉病抗性[J].  果树科学，1988，5（3）：120-121.

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[15] 陈佰鸿，李新生，曹孜义，等.  一种用透明胶带粘取叶片表皮观察气孔的方法[J].  植物生理学通讯，2004，40（2）：215-218.

[16] BOUBALS. D.  A contribution to the study of causes of the resistance of vitaceae to downy mildew and their mode inheritance[J].  Plant Breeding Abstracts，1959，

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（本文责编：陈    珩）