参芪补肺方对慢性阻塞性肺疾病稳定期大鼠Nrf2和γ-GCS表达的影响

李竹英 王婷 田春燕

〔摘要〕 目的 探讨参芪补肺方对大鼠肺组织红系衍生核因子相关因子-2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（gamma-glutamylcysteines-ynthetase，γ-GCS）的 mRNA 及蛋白表达水平的影响。方法 将40只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、中药组、富露施组，每组各10只。除空白组外，其余3组均采用香烟烟雾熏制和经鼻给予脂多糖 （lipopolysaccharides，LPS）制作慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）大鼠模型，且给予相应干预，连续灌胃30 d。于第38天对大鼠进行麻醉并提取肺组织，通过RT-PCR法檢测Nrf2和γ-GCS的mRNA表达水平，通过免疫组化法、Western blot法检测Nrf2和γ-GCS蛋白表达水平。结果 中药组、富露施组大鼠Nrf2、γ-GCS的mRNA和蛋白表达均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;中药组大鼠Nrf2、γ-GCS 的mRNA和蛋白表达与富露施组组间比较差异无统计学意义（P>0.05），疗效相当。结论 参芪补肺方能够通过降低Nrf2、γ-GCS的mRNA及蛋白的表达，减轻COPD大鼠的氧化应激反应。

〔关键词〕 参芪补肺方;红系衍生核因子相关因子;γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶;脂多糖;慢性阻塞性肺疾病

〔中图分类号〕R285.5;R563       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.008

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以气流受限且不完全可逆为特征，常呈进行性发展，与气道、肺的慢性炎症反应有关的疾病[1]。因COPD发病率与病死率逐年增长、社会经济负担逐渐加重等，COPD的防治现已受到全球的广泛重视[2-3]。研究证实氧化/抗氧化失衡是 COPD 的主要发病机制[4-7]。还原型谷胱甘肽（GSH）是一种含有巯基的抗氧化物，在维持肺上皮屏障完整性方面起核心作用，有消除体内氧自由基（reactive oxygenspecies，ROS）、抵御外源性氧化剂对肺持续性损伤的作用。而γ-GCS又是GSH合成过程中的关键性限速酶，对GSH的合成起控制作用。肖敏敏[8]发现氧化应激刺激γ-GCS上调，增加γ-GCS mRNA表达及活性，促进GSH生成速率及生成量，增强GSH的抗氧化作用，进而减轻氧化应激对肺组织的损伤。除γ-GCS以外，红系衍生核因子相关因子-2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）也是一种重要的调控抗氧化基因表达的核转录因子[9]。

前期实验结果表明参芪补肺方治疗COPD效果颇佳，该药可以改善肺功能水平，降低COPD大鼠BALF炎症程度，抑制COPD大鼠肺组织病理进程，提高COPD大鼠肺组织miR-146表达，降低大鼠肺组织黏蛋白5AC水平[10-11]。本文将探讨参芪补肺方对COPD大鼠肺组织Nrf2、γ-GCS的影响，并对其作用机制进行初步研究。

1 材料

1.1  动物

健康雌性Wistar大鼠40只，鼠龄在50 d左右，体质量（200±30）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（黑）2008-004。

1.2  药物制备

参芪补肺方：党参20 g，黄芪20 g，熟地黄15 g，补骨脂15 g，五味子15 g，淫羊藿15 g，黄精15 g，山茱萸15 g，紫菀15 g，款冬花15 g，清半夏10 g，紫苏子15 g，地龙10 g，甘草5 g，共计200 g。由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备（每剂56 mL，含生药200 g）， 按照人（70 kg）与大鼠（220 g）体表面积系数0.018计算，每只大鼠每日5 mL/kg灌胃治疗。富露施：将富露施（乙酰半胱氨酸颗粒）配制成185 mL的溶液（含富露施2 g），大鼠每日0.054 g/kg灌胃治疗。

1.3  主要试剂及仪器

脂多糖（LPS）（美国 Sigma 公司）;富露施：意大利赞邦集团（批号：H20000471）;大前门牌香烟（上海烟草公司生产）;总RNA提取TRIZOL试剂盒（美国Invitrogen公司）;自制动物烟熏箱（50 cm×65 cm×145 cm）;高速低温离心机（Eppendorf公司）;酶标仪（北京六一公司WD-9405B）;荧光定量PCR仪（美国 BIO-RAD公司）;水平电泳槽机（美国BIO-RAD公司）;甩片机（美国BIO-RAD公司）;一抗山羊抗兔Nrf2、γ-GCS（beyotime公司 A0208）;二抗山羊抗小鼠Nrf2、γ-GCS（beyotime公司 A0216）。

2 方法

2.1  分组

适应性喂养1周后，将40只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、中药组、富露施组，每组10只。

2.2  模型制备及干预

模型组、富露施组、中药组参照崔德健[12]和赵春玲等[13]实验方法建立COPD大鼠模型，将大鼠置于自制烟熏箱（50 cm×65 cm×145 cm）内，箱体下侧壁有一个通气孔，箱体左顶端有排烟孔，在箱内燃烧器内点燃20 g香烟烟丝，待烟雾完全散去后取出各组大鼠，全程约30 min，每日1次，除滴药日外，连续烟熏24 d。除空白组外，其余各组分别于实验开始的第1、8、15、22天给予LPS（1 mg/mL）0.1 mL滴鼻。自实验第9天起，中药组大鼠每日17.86 g/kg参芪补肺方汤剂灌胃1次;富露施组每日0.054 g/kg富露施药液灌胃1次;模型组每日0.9%NaCl5 mL/kg灌胃，共计给药治疗30 d。

2.3  标本采集

于实验第38天药物治疗结束后4 h，称质量并2%戊巴比妥（35 mg/kg） 腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠仰卧固定于鼠板，胸部皮消毒后切开胸部暴露肺部，沿肺门剪下右肺，经PBS漂洗后，取副叶、后叶4 ℃下固定2 h，进行石蜡包埋及切片，片厚5 μm;前叶浸在RNA later保存液中，-80 ℃保存，留作RT-PCR检测;中叶放入3 mLEP管中，-80 ℃保存，备用。

2.4  标本检测

2.4.1  RT-PCR检测Nrf2、？酌-GCSmRNA表达  称取大鼠肺组织100 mg按照说明书提取RNA，测量RNA的纯度，取1 μL总 RNA用DEPC水稀釋100倍，放于酶标仪测定 OD26O、OD280 值。按照RT-PCR试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，取上述反应产物2 μLcDNA，其中加入上下游引物各1.5 μL;TaqDNA聚合酶混合物8 μL;ddH2O 7 μL。反应条件：预变性：95 ℃ 4 min;变性：温度94 ℃，时间30 s;退火：温度50 ℃，时间1 min;延伸：温度72 ℃，时间30 s;终末延伸：温度72 ℃，时间5 min。用凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带，条带与内参照 GAPDH 扩增带的吸光度比值作为其mRNA表达水平的相对指标。各引物序列见表1。

2.4.2  免疫组化法检测Nrf2、？酌-GCS蛋白的表达  将后叶切片脱蜡至水（所用试剂为二甲苯、无水、95%、85%、70%酒精、蒸馏水）。然后依次进行灭活，暴露抗原结合位点，蒸馏水冲洗3次，用PBS按1∶100稀释孵育一抗，湿盒内4 ℃过夜，二抗用PBS稀释200倍，滴加至完全覆盖组织，湿盒内37 ℃孵育30 min，浸泡在PBS中5 min，重复3次，滴加SABC，DAB显色，复染、脱水、透明、中性树胶封片，每组内随机挑选3个200倍视野的照片。

2.4.3  Western blot法检测Nrf2、γ-GCS蛋白的表达  分别提取各组组织蛋白，依据 BCA 法蛋白含量检测试剂盒说明测定蛋白浓度。将0.5 μg/μL的BSA蛋白标准液按照0、1、2、4、8、12、16、20 μL体积分装于酶标板各孔，剩余体积用PBS缓冲液补齐至20 μL。将各组待测样本蛋白1 μL与19 μL PBS混匀。按照A液：B液体积比50∶1制成BCA工作液，加入各孔中充分混匀后，置于37 ℃反应20 min，将酶标板置于载台上，进行读数，记录数据。按照Western blot操作步骤操作，制备8%分离胶、5%浓缩胶，每个泳道各加入40 μg样蛋白，经 SDS-PAGE 恒压电泳、转膜，脱脂牛奶封闭，用1∶500比例稀释一抗进行孵育; 二抗按1∶1 000比例稀释，ECL底物发光，将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。

2.5  统计学方法

运用SPSS 16.0软件分析数据。符合正态分布的计量资料运用t检验，不符合正态分布的计量资料运用非参数检验。计数资料采用卡方（？字2）检验。若P<0.05则有统计学意义。

3 结果

3.1  大鼠肺组织Nrf2、γ-GCS mRNA表达水平比较

与空白组比较，其他各组大鼠Nrf2、γ-GCSmRNA表达均显著升高（P<0.05），说明COPD大鼠模型成立;富露施组、中药组Nrf2、γ-GCS mRNA表达均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）; 中药组Nrf2、γ-GCS mRNA的表达与富露施组比较无显著差异（P>0.05），疗效相当。提示参芪补肺方能够缓解大鼠肺组织的氧化应激反应，降低Nrf2、γ-GCSmRNA水平。见表2。

3.2  大鼠肺组织Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平比较

空白组Nrf2、γ-GCS蛋白的表达明显低于模型组、富露施组、中药组，具有统计学意义（P<0.05）;模型组Nrf2、γ-GCS蛋白的表达高于富露施组、中药组（P<0.05），提示参芪补肺方能够缓解大鼠肺组织的氧化应激反应，降低Nrf2、γ-GCS蛋白水平。见表3，图1-图3。

4 讨论

研究发现，吸烟会刺激机体释放大量ROS、炎症细胞及氧化剂，这种大量蓄积可引起细胞毒性，造成肺组织损伤[14]。为了消除多余的氧化物质，机体诱导γ-GCS增加，刺激GSH大量合成、活化，起到抗氧化作用。相关研究证实GSH不仅具有重要的抗氧化作用，而且具有维护气道上皮完整、减轻气道炎症等作用[18]。Nrf2是COPD治疗中的关键转录激活因子，具有调控γ-GCS基因表达的关键作用，在正常状态下，Nrf2以非活化的形式存在于胞浆中，不具有抗氧化作用，但当机体氧化/抗氧化失衡时，则可活化Nrf2，进而促进γ-GCS的高表达，来对抗氧化应激，因此对于COPD的治疗，可以通过增加Nrf2的活化使γ-GCS的表达快速增多，使机体产生更多的抗氧化物质，从而减慢和延缓COPD恶化[15-16]。

COPD可归为中医学中“肺胀”的范畴，气虚、血瘀、痰阻是COPD稳定期的主要病机特点，调补肺肾、化痰行瘀是治疗COPD稳定期的重要治法。参芪补肺方中君药为黄芪、党参，黄芪补肺脾元气、益卫固表，党参益气补肺，合用增补肺益气之效;臣药熟地黄、黄精补肾纳气平喘，五味子敛肺止咳，补骨脂、淫羊藿补肾壮阳，共奏滋阴补肾润肺，温肾助阳之功;佐药紫菀、款冬花降气止咳，紫苏子、清半夏、地龙敛肺化痰、祛风平喘，山茱萸补肝益肾、收敛固涩;使药甘草，止咳化痰，调和药性。全方肺肾得补，痰湿得消。临床表明运用参芪补肺方治疗COPD稳定期疗效显著[17]。

本实验结果显示，中药组Nrf2、γ-GCS mRNA和蛋白的表达均低于模型组，差异具有统计学意义（P<0.05），说明中药组的氧化应激反应轻于模型组，参芪补肺方对COPD 有治疗作用，这可能是由于通过参芪补肺方的灌胃治疗，缓解并减轻了外源性氧化剂、ROS、炎症细胞等对大鼠肺组织的持续损伤，使得Nrf2、γ-GCS mRNA和蛋白的表达相对性的降低，这为参芪补肺方治疗COPD的作用机制研究提供了新思路。参芪补肺方对Nrf2、γ-GCS mRNA和蛋白表达的影响，将为COPD的治疗开辟新途径。

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