苗药黑骨藤多指标的含量测定及聚类分析

2018-09-10刘育辰刘丽苹刘刚金文渊龙毅黄明喆杨欣

中国药房 2018年12期

刘育辰刘丽苹刘刚金文渊龙毅黄明喆杨欣

中图分类号 R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）12-1636-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.12

摘要目的：建立同时测定苗药黑骨藤中绿原酸和杠柳毒苷含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Xtimate C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为220 nm，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。采用SPSS 23.0统计软件根据药材样品中绿原酸和杠柳毒苷的含量进行聚类分析。结果：绿原酸、杠柳毒苷检测进样量线性范围分别为0.040 6～1.8 μg（r=0.999 4）、0.016 8～2.3 μg（r=0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于5.0%；定量限分别为0.918 0、0.084 3 μg/mL，检测限分别为0.102 0、0.025 3 μg/mL；加样回收率分别为102.66%～104.00%（RSD=0.53%，n=6）、96.44%～100.79%（RSD=1.73%，n=6）；耐用性试验的RSD均小于3.0%。18份药材样品可聚为三大类，即S2、S4、S10、S12、S14～S18聚为一类，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚为一类，S8为一类。结论：该方法可用于黑骨藤药材的质量控制和品质评价；不同产地黑骨藤药材中绿原酸和杠柳毒苷的含量有较大差异，各成分含量与产地有一定关联。

关键词黑骨藤；绿原酸；杠柳毒苷；含量测定；聚类分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of chlorogenic acid and periplocin in Miao medicine Periploca forrestii. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Xtimate C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 220 nm， and column temperature was maintained at 25 ℃. The sample size was 10 μL. Cluster analysis was conducted according to the content of chlorogenic acid and periplocin in samples by SPSS 23.0 software. RESULTS： The linear range of chlorogenic acid and periplocin were 0.040 6-1.8 μg（r=0.999 4） and 0.016 8-2.3 μg（r=0.999 9）， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all lower than 5.0%. The quantitation limits were 0.918 0， 0.084 3 μg/mL， and detection limits were 0.102 0， 0.025 3 μg/mL， respectively. RSD of durability were lower than 3.0%. The recoveries were 102.66%-104.00%（RSD=0.53%，n=6）， 96.44%-100.79%（RSD=1.73%，n=6），respectively. RSD of durability were lower than 3.0%. The result indicated that 18 batches of samples were divided into 3 categories by cluster analysis. S2， S4， S10， S12 and S14-S18 were divided into one category； S1， S3， S5-S7， S9， S11 and S13 were divided into another category； S8 was regarded as one category. CONCLUSIONS： The method can be applied for quality control and evaluation of P. forrestii. The contents of chlorogenic acid and periplocin in P. forrestii from different producing areas are different greatly. There is a certain correlation between the content of each component and the producing area.

KEYWORDS Periploca forrestii； Chtorogenic acid； Periplocin； Content determination； Cluster

黑骨藤为萝藦科（Asclepiadaceae）杠柳属（Periploca）植物黑龙骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株，又名飞仙藤、黑骨头、柳叶过山龙、滇杠柳等，苗语称嘎八又赊、锐松怪、蛙蟒塞，其味苦，辛、温，有小毒，具有祛风除湿、通经活络之功效，多用于治疗风湿关节痛、跌打损伤、乳腺炎、闭经等病症。主要分布在贵州、云南、广西、西藏等地，生长于2 500米以下山地疏林向阳处、阴湿杂木林下及灌木叢中[1-2]。

黑骨藤药材通常为野生，无规范种植基地，药材质量难以控制，目前仍执行的是2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》[3]，此标准中只有来源、性状、显微鉴别和理化鉴别等传统项目。研究发现，黑骨藤药材含有黄酮类[4]、香豆素类[5]、强心苷类[6]、三萜类[6]、酚酸类[7]、C21甾类[4]、神经酰胺类[8]等多种成分，但目前其含量测定主要集中于总皂苷[9]、总黄酮[10]、黄酮苷[11]、强心苷[12]等单一指标。药理实验证明，黑骨藤药材中咖啡酰基奎宁酸类成分和滇杠柳苷类成分分别具有抗类风湿性关节炎[13]和强心作用[14]。因此，本研究以上述两类活性成分的代表绿原酸和杠柳毒苷作为质量控制指标，采用高效液相色谱法（HPLC）对贵州省不同产地的黑骨藤药材中两种成分的含量进行测定，并进行聚类分析，以便更全面地评价其质量。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate-3000 型HPLC仪，包括自动进样系统、柱温箱、二级管阵列检测器和Chromeleon 色谱工作站[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；DRHH-2型数显恒温水浴锅（上海双捷实验设备有限公司）；Q-2508型高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司）；JT1003型电子分析天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）。

1.2 试剂

绿原酸对照品（批号：MUST-16031610，纯度：>98%）、杠柳毒苷对照品（批号：MUST-16072202，纯度：>98%）均购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

18份药材样品采自贵州省不同产地（见表1），经贵阳中医学院刘刚实验师鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～12 min，9%→10% A；12～30 min，10%→21% A；30～50 min，21%→35% A；50～60 min，35%→70% A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液精密称取绿原酸对照品5.08 mg，置于5 mL量瓶中，以流动相溶解并定容，摇匀，制成质量浓度为1.016 mg/mL的绿原酸对照品溶液；精密称取杠柳毒苷对照品8.40 mg，置于10 mL量瓶中，以流动相溶解并定容，摇匀，制成质量浓度为0.840 mg/mL的杠柳毒苷对照品溶液。再精密量取上述绿原酸对照品溶液2 mL、杠柳毒苷对照品溶液1 mL，置于同一50 mL量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成绿原酸、杠柳毒苷质量浓度分别为0.040 6、0.016 8 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液精密称取药材样品粉末2.0 g，按料液比1 ∶ 25加入70%乙醇溶液50 mL，加热回流提取3次，每次1 h，合并提取液，于70 ℃水浴蒸干，加25 mL水使成混悬液，分别依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取3次，将3次正丁醇萃取液合并，浓缩至干，残渣用适量甲醇溶解，转移并定容至10 mL量瓶中，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果，理论板数按绿原酸、杠柳毒苷峰计应大于5 000；保留时间分别为17.2、46.0 min，表明基線分离良好。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液1、5、10、14、20、25 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得绿原酸、杠柳毒苷回归方程分别为y=36.258x-0.765 8（r=0.999 4）、y=19.240x-0.269 5（r=0.999 9）。结果表明，绿原酸、杠柳毒苷检测进样量线性范围分别为0.040 6～1.8、0.016 8～2.3 μg。

2.5 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限；当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限。结果，绿原酸、杠柳毒苷定量限分别为0.918 0、0.084 3 μg/mL，检测限分别为0.102 0、0.025 3 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，绿原酸、杠柳毒苷峰面积的RSD分别为0.16%、1.64%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S1）8份，分别于室温下放置1、3、5、9、12、15、18、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、杠柳毒苷峰面积的RSD分别为4.15%、1.34%（n=8），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取药材样品（编号：S1）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，绿原酸、杠柳毒苷含量平均值分别为0.230 8、0.062 2 mg/g，RSD分别为 4.17%、2.41%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量药材样品（编号：S1）6份，每份1 g，分别加入绿原酸、杠柳毒苷对照品溶液各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.10 耐用性试验

2.10.1 流速考察精密称取药材样品（编号：S2）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液1份，再按“2.1”项下色谱条件（流速分别为0.8、1.0、1.2 mL/min）进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，绿原酸、杠柳毒苷含量平均值分别为0.232 4、0.062 1 mg/g，RSD分别为2.54%、1.70%，表明流速一定程度波动能满足试验要求，本方法耐用性良好。

2.10.2 柱温考察精密称取药材样品（编号：S2）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液1份，再按“2.1”项下色谱条件（柱温分别为25、30、35 ℃）进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，绿原酸、杠柳毒苷含量平均值分别为0.231 5、0.061 0 mg/g，RSD分别为0.90%、2.70%，表明柱温一定程度波动能满足试验要求，本方法耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取18份药材样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表3。

2.12 聚类分析

以各共有峰相对峰面积为变量，采用SPSS 23.0统计软件对药材样品进行聚类分析，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，结果见图2。由图2可见，聚类谱系中，将18份药材样品聚为三大类：即S2、S4、S10、S12、S14～S18聚为一类，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚为一类，S8为一类。

3 讨论

由表3可知，药材样品中绿原酸含量为0.047 1～0.376 0 mg/g，贵阳市乌当区相思河产药材样品中绿原酸含量最低，安顺市产药材样品中绿原酸含量最高；杠柳毒苷含量为0.016 1～0.485 2 mg/g，贵阳市乌当区相思河产药材样品中杠柳毒苷含量最低，安顺市产药材样品中杠柳毒苷含量最高。从各地区药材样品2种成分含量上来看，绿原酸和杠柳毒苷含量似有所关联，即贵阳市乌当区相思河产药材样品上述2种成分含量均最低，而安顺市产药材样品上述2种成分含量均最高，绿原酸含量两产地药材样品相差约8倍，杠柳毒苷含量两产地药材样品相差约30倍。笔者采样过程中发现，黑骨藤药材生长对周围生态环境的选择性非常强，它喜欢生长在向阴、水分充足的密林中。而安顺市药材产地环境恰恰符合上述特点。

聚类分析结果表明，绿原酸和杠柳毒苷含量与黑骨藤药材的产地具有一定的联系。18份药材样品主要聚为三大类，S1、S3、S5～S7、S9、S11、S13聚为一类，它们所处地理位置均在贵阳市以北区域；S2、S4、S10、S12、S14～S18聚为一类，它们所处地理位置基本在贵阳市以南区域；而自成一类的S8，其所处地理位置也在贵阳市以南区域。

综上所述，本方法可用于黑骨藤药材的质量控制和品质评价；不同产地黑骨藤药材中绿原酸和杠柳毒苷的含量有较大差异，各成分含量与产地有一定关联。本结论为该药材最佳产地的确定奠定了一定基础，有助于指导药材种植及采收。

参考文献

[ 1 ] 邱德文，杜江. 中华本草：苗药卷[M].贵阳：贵州科技出版社，2005：526-527.

[ 2 ] 邱德文，杜江. 贵州十大苗药研究[M].北京：中国古籍出版社，2008：261-324.

[ 3 ] 贵州省药品监督管理局. 贵州省中药材、民族藥材质量标准[M]. 2003年版.贵阳：贵州科技出版社，2003：381.

[ 4 ] 张嫩玲，刘香，沈春祥，等. 黑龙骨的化学成分[J].中药材，2016，39（2）：329-330.

[ 5 ] 李勇，刘云宝，庾石山. 黑龙骨化学成分研究[J].中国中药杂志，2013，38（10）：1536-1538.

[ 6 ] 徐冉，杜娟，邓璐璐，等. 滇杠柳中的一个新强心苷[J].中国中药杂志，2012，37（15）：2286-2288.

[ 7 ] 赵珊，张宝，熊丹丹，等.苗药黑骨藤化学成分的研究[J].中草药，2017，48（8）：1513-1518.

[ 8 ] 赵超，甘秀海，龚小见，等. 黑骨藤中神经酰胺类化学成分[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（23）：83-85.

[ 9 ] 申海艳，龚小见，李文敏，等. 苗药黑骨藤中总皂苷含量的测定[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：94-97.

[10] 景小楠，钟菡，张宏，等. 黑骨藤中总黄酮含量的测定[J].四川师范大学学报（自然科学版），2010，33（1）：89- 92.