HPLC法同时测定鼻炎灵片中绿原酸、黄芩苷和欧前胡素的含量

邱红梅 杨林 何丹

中图分类号 R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）12-1605-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.05

摘 要 目的：建立同时测定鼻炎灵片中绿原酸、黄芩苷和欧前胡素含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Waters SunFire C18，流动相为甲醇-0.20%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。结果：绿原酸、黄芩苷和欧前胡素的检测质量浓度线性范围分别为1.618～16.18、1.624～16.24、1.762～17.62 μg/mL（r均为0.999 9）；定量限分别为2.67、2.03、1.87 μg/mL，检测限分别为1.34、1.06、0.98 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2.0%；加样回收率分别为98.01%～101.80%（RSD=1.38%，n=9）、98.38%～101.40%（RSD=1.26%，n=9）、98.06%～101.40%（RSD=1.28%，n=9）；耐用性试验的RSD均小于2.0%。结论：该方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性、耐用性好，可用于鼻炎灵片中绿原酸、黄芩苷和欧前胡素含量的同时测定。

关键词 高效液相色谱法；鼻炎灵片；绿原酸；黄芩苷；欧前胡素；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of chlorogenic acid， baicalin and imperatorin in Biyanling tablets. METHODS： HPLC method was adopted. The separation was performed on a Waters SunFire C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.20% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. RESULTS： Linear ranges of chlorogenic acid， baicalin and imperatorin were 1.618-16.18 μg/mL， 1.624-16.24 μg/mL and 1.762-17.62 μg/mL （r were 0.999 9）， respectively. The limits of quantitation were 2.67，2.03，1.87 μg/mL， and the limits of detection were 1.34， 1.06， 0.98 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%. The recoveries were 98.01%-101.80%（RSD=1.38%，n=9）， 98.38%-101.40%（RSD=1.26%，n=9）and 98.06%-101.40%（RSD=1.28%，n=9）， respectively. RSDs of tolerance tests were all lower than 2.0%. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable. It can be used for simultaneous determination of hlorogenic acid， baicalin and imperatorin in Biyanling tablets.

KEYWORDS HPLC； Biyanling tablet； Chlorogenic acid； Baicalin； Imperatorin； Content determindtion

鼻炎灵片是由炒苍耳子、辛夷、白芷、黄芩、川贝母、细辛、淡豆豉、薄荷脑等8味中藥材经提取制成的口服制剂，具有通窍消肿、祛风退热的功效，临床上多用于慢性鼻窦炎、鼻炎及鼻塞头痛、浊涕臭气、嗅觉失灵等症的治疗[1]。该制剂收载于2015年版《中国药典》（一部），现有标准采用薄层色谱法对白芷、黄芩和川贝母进行鉴别，以高效液相色谱法（HPLC）测定黄芩苷的含量，并规定每片含黄芩以黄芩苷计不得少于2.4 mg[1]。苍耳子、黄芩、白芷为该方的主要药材，因此该制剂的质量控制应采用多指标成分控制。苍耳子主要含有绿原酸、原儿茶酸等酚酸类成分[2-3]，具有降血糖、抗过敏、抗菌、抗炎、镇痛等作用[4]；黄芩主要含有黄芩苷等成分[5]，具有抗炎、抗菌、镇静、解热、降血压、降血脂及降胆固醇等作用[6]；白芷中主要含有欧前胡素和异欧前胡素等香豆素类成分[7]，具有抗炎、抗疟、抗菌、抗肿瘤等作用[8]。目前，文献报道的质量控制方法多以HPLC法分别测定该制剂中黄芩苷[9]、绿原酸[10]、木兰脂素[11]和欧前胡素[12]的其中1种或2种成分的含量，但未见同时测定该制剂中绿原酸、黄芩苷和欧前胡素含量的报道。本研究采用HPLC法建立了同时测定鼻炎灵片中上述3种成分含量的方法，旨在为该制剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20型HPLC仪，包括SPD-20A紫外-可见分光检测器（日本Shimadzu公司）；AG135型电子分析天平（瑞士Mettler -Toledo公司）；KQ-1100DE型超声波清洗仪（昆山舒美超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

鼻炎灵片（江西南昌制药有限公司，批号：170306、170402、170508，规格：0.3 g/片）；绿原酸对照品（批号：110753-201415，纯度：≥99.0%）、黄芩苷对照品（批号：110896-200001，纯度：≥99.0%）、欧前胡素对照品（批号：110826-201013，纯度：≥99.0%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.20%磷酸溶液，梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取绿原酸对照品10.11 mg、黄芩苷对照品10.15 mg、欧前胡素对照品11.01 mg，各置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得各自单一对照品贮备液。分别量取上述3种单一对照品贮备液各1.0 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得绿原酸、黄芩苷和欧前胡素质量浓度分别为16.18、16.24、17.62 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品20 片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 mL，密塞，称定质量，超声（功率：250 W，频率：40 kHz） 处理 40 min，放冷，再次称定质量，用流动相补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按鼻炎灵片处方和工艺制备缺炒苍耳子、白芷、黄芩的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果，阴性对照在与绿原酸、黄芩苷和欧前胡素保留时间相同处无色谱峰干扰，表明专属性良好。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加流动相定容，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以绿原酸、黄芩苷和欧前胡素质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得绿原酸、黄芩苷和欧前胡素回归方程分别为y=17 386x+50 694（r=0.999 9）、y=45 610x+56 650（r=0.999 9）、y=22 240x+31 953（r=0.999 9）。结果表明，绿原酸、黄芩苷和欧前胡素检测质量浓度线性范围分别为1.618～16.18、1.624～16.24、1.762～17.62 μg/mL。

2.5 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限；当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限。结果，绿原酸、黄芩苷和欧前胡素的定量限分别为2.67、2.03、1.87 μg/mL，检测限分别为1.34、1.06、0.98 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，1 d内按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，绿原酸、黄芩苷和欧前胡素峰面积的RSD分别为1.32%、1.18%、0.98%（n=6），表明日内精密度良好。取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续3 d进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、黄芩苷和欧前胡素峰面积的RSD分别为1.48%、1.35%、1.28%（n=3），表明日间精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：170306）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果， 绿原酸、黄芩苷和欧前胡素峰面积的RSD分别为1.25%、1.08%、1.18%（n=6），表明供试品溶液室温放置10 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取样品细粉（批号：170306）適量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，绿原酸、黄芩苷和欧前胡素含量平均值分别为2.330、4.412、3.526 mg/片，RSD分别为1.50%、1.27%、1.19%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品细粉（批号：170306）适量，共9份，分别加入低、中、高质量浓度的混合对照品溶液各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.10 耐用性试验

2.10.1 色谱柱考察 取样品细粉（批号：170306）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液1份，再按“2.1”项下色谱条件[色谱柱分别为Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Cosmocore C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]进样测定，记录峰面积并计算含量，结果见表3。结果表明，色谱柱一定程度波动能满足试验要求，本方法耐用性良好。

2.10.2 流动相考察 取样品细粉（批号：170306）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液1份，再按“2.1”项下色谱条件（流动相磷酸溶液体积分数分别为0.20%、0.15%、0.10%）进样测定，记录峰面积并计算含量，结果见表3。结果表明，流动相一定程度波动能满足试验要求，本方法耐用性良好。

2.10.3 流速考察 取样品细粉（批号：170306）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液1份，再按“2.1”项下色谱条件（流速分别为0.8、1.0、1.2 mL/min）进样测定，记录峰面积并计算含量，结果见表3。结果表明，流速一定程度波动能满足试验要求，本方法耐用性良好。

2.10.4 柱温考察 取样品细粉（批号：170306）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液1份，再按“2.1”项下色谱条件（柱温别为25、30、35 ℃）进样测定，记录峰面积并计算含量，结果见表3。结果表明，柱温一定程度波动能满足试验要求，本方法耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

3 讨论

由于绿原酸、黄芩苷和欧前胡素极性差别较大，故笔者采用梯度洗脱，并在流动相优化过程中分别采用不同体积分数的磷酸溶液，结果发现在0.20%磷酸溶液条件下，上述3种成分峰形对称，可满足测定要求。在检测波长优化过程中笔者选用280 nm和328 nm两个波长进行比较，发现在280 nm波长处上述3种成分的色谱峰峰形较好，且整个基线更为平稳。笔者还曾以甲醇、50%甲醇作为提取溶剂，可能是制剂中某些辅料的干扰所致，结果不理想；而后发现流动相作为提取溶剂提取最为完全，加样回收率符合规定。

綜上所述，本方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性、耐用性好，可用于鼻炎灵片中绿原酸、黄芩苷和欧前胡素含量的同时测定。

参考文献

[ 1 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：1686

[ 2 ] JIANG H， YANG L， LIU C， et al. Four new glycosides from the fruit of Xanthium sibiricum Patr[J]. Molecules， 2013， 18（18）：12464-12473.

[ 3 ] 姜海，张妍妍，张颖.苍耳子化学成分研究[J].中医药信息，2016，33（3）：8-10.

[ 4 ] 刘玉红，郝震峰.苍耳子的化学成分和药理作用研究概述[J].南京中医药大学学报， 2017，33 （4） ：22-23.

[ 5 ] 徐丹洋，陈佩东，张丽，等.黄芩的化学成分研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：78-80.

[ 6 ] 文敏，李雪，付守延.黄芩苷药理作用研究新进展[J].沈阳药科大学学报，2008，25（2）：158.

[ 7 ] 张建方，黄健，叶优苗.HPLC法测定利鼻片中欧前胡素的含量[J].中国药房，2013，24（12）：1135-1136.

[ 8 ] 夏令先，王玉斌，黄文龙，等.香豆素类化合物的抗肿瘤作用研究进展[J].中国新药杂志，2013，22（20）：2392-2402.

[ 9 ] 郝晶晶，甄会贤，赵正保.鼻炎灵片中黄芩苷含量测定方法的研究[J].山西中医学院学报，2013，14（1）：38-40 .

[10] 孙亮，郑巍，陆萍，等.鼻炎灵胶囊中绿原酸和黄芩苷的含量测定及指纹图谱研究[J].药学服务与研究，2016，16（3）：196-199.

[11] 夏清山.HPLC测定鼻炎片中木兰脂素的含量[J].鄂州大学学报，2010，17（5）：18-19.

[12] 越春香，粱蕊，互丽娜.HPLC法测定鼻炎灵片中欧前胡素的含量[J].中草药，2004，35（6）：642-643.

（收稿日期：2017-10-23 修回日期：2018-01-09）

（编辑：张 静）