HPLC法同时测定药用卤化丁基胶塞中5种抗氧剂和游离硫的含量

朱碧君 李婷婷 孙会敏 胡星宇 何君怡 罗跃华

中圖分类号 R927 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）18-2475-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.07

摘 要 目的：建立同时测定药用卤化丁基胶塞中2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，流动相为甲醇-水（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为220 nm，进样量为10 μL。结果：BHT、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的检测质量浓度线性范围分别为2.592～64.80 μg/mL（r=0.999 9）、2.648～66.20 μg/mL（r=0.999 9）、2.062～51.55 μg/mL（r=0.999 9）、2.654～66.35 μg/mL（r=0.999 9）、2.128～53.20 μg/mL（r=0.999 9）、2.468～61.70 μg/mL（r=0.999 9）；定量限分别为2.073 6、2.118 4、2.749 2、1.061 6、4.436 0、3.090 4 mg/kg，检测限分别为0.628 4、0.641 9、0.833 1、0.321 7、1.344 2、0.992 4 mg/kg；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%；加样回收率分别为96.57%～99.17%（RSD=0.92%，n=9）、77.47%～86.14%（RSD=2.94%，n=9）、96.11%～98.39%（RSD=0.63%，n=9）、96.22%～98.33%（RSD=0.67%，n=9）、95.59%～99.22%（RSD=1.11%，n=9）、81.54%～88.31%（RSD=2.46%，n=9）。结论：该方法灵敏快速、操作简便、重复性好，可用于同时测定药用卤化丁基胶塞中5种抗氧剂和游离硫的含量。

关键词 药用卤化丁基胶塞；2，6-二叔丁基对甲酚；游离硫；抗氧剂1010；抗氧剂330；抗氧剂1076；抗氧剂168；高效液相色谱法；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of BHT， free sulfur， antioxidant 1010， antioxidant 330， antioxidant 1076 and antioxidant 168 in pharmaceutical halogenated butyl rubber stopper. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Zorbax SB-C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 25 ℃， and detection wavelength was set at 220 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of BHT， free sulfur， antioxidant 1010， antioxidant 330， antioxidant 1076 and antioxidant 168 were 2.592-64.80 μg/mL （r=0.999 9）， 2.648-66.20 μg/mL （r=0.999 9）， 2.062-51.55 μg/mL （r=0.999 9）， 2.654-66.35 μg/mL （r=0.999 9）， 2.128-53.20 μg/mL （r=0.999 9）， 2.468-61.70 μg/mL （r=0.999 9）， respectively. The limits of quantitation were 2.073 6， 2.118 4， 2.749 2， 1.061 6， 4.436 0， 3.090 4 mg/kg； the limits of detection were 0.628 4， 0.641 9， 0.833 1， 0.321 7， 1.344 2， 0.992 4 mg/kg， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3%. The average recoveries were 96.57%-99.17%（RSD=0.92%， n=9）， 77.47%-86.14%（RSD=2.94%， n=9）， 96.11%-98.39%（RSD=0.63%， n=9）， 96.22%-98.33%（RSD=0.67%， n=9）， 95.59%-99.22%（RSD=1.11%， n=9） and 81.54%-88.31%（RSD=2.46%， n=9）， respectively. CONCLUSIONS： The method is sensitive， rapid， convenient and reproducible， and can be used for simultaneous determination of 5 antioxidant and free sulfur in pharmaceutical halogenated butyl rubber stopper.

KEYWORDS Pharmaceutical halogenated butyl rubber stopper； BHT； Free sulfur； Antioxidant 1010； Antioxidant 330； Antioxidant 1076； Antioxidant 168； HPLC； Content determination

药用卤化丁基胶塞是药品包装中瓶装密封材料的重要组成部分，具有吸湿率低、耐化学性及气密性好、无生理毒副作用等特点[1]。实际使用过程中，药用卤化丁基胶塞会直接与药物接触，而由于其在加工过程中需加入多种添加剂，如抗氧剂2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、抗氧剂1010等来抑制或延缓其氧化过程，此外还需经硫化处理，因而不可避免地会在胶塞内残存一些未被化学键合的反应剩余物、不参与反应的物质及热分解的产物，如游离硫[2]等，这些物质可能会通过吸附、吸收、渗透和抽提等方式与药物发生反应，从而影响和污染药物[3-10]，随药物进入人体后可能会引起不良反应，危害健康[11-12]。2015年版《国家药包材标准》中的“药品包装材料与药物相容性试验指导原则”指出，鉴于橡胶配方的复杂性，应重点考察其中各种添加物的溶出对药物的作用、橡胶对药物的吸附以及填充材料在溶液中的脱落[13]。为此，本研究参考相关文献[14-18]，采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定了药用卤化丁基胶塞中BHT、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的含量，以为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括四元梯度泵、柱温箱、自动进样器、紫外可变波长检测器、二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）； AE-240型电子天平、AEG220型电子天平（日本岛津公司）；Milli-Advantage A10超纯水装置（美国密理博公司）。

1.2 包材与试剂

BHT对照品（批号：LB68565，纯度：99.900%）、硫磺对照品（批号：L01272，纯度：99.999%）、抗氧剂1010对照品（批号：MKBC8710V，纯度：100%）、抗氧剂330 对照品（批号：05928TI，纯度：100%）、抗氧剂1076 对照品（批号：MKBB8963，纯度：100%）、抗氧剂168 对照品（批号：MKAA3717，纯度：100%）均由美国Sigma-Aldrich公司提供； 药用卤化丁基胶塞（江苏博生医用新材料股份有限公司，批号：16051314、16050750、16033014，规格：20A、32A、20-B2-2；江苏华兰药用新材料股份有限公司，批号：13032246-60，规格：三叉20-A4-1；南昌市君健橡塑制品有限公司，批号：20150601，规格：15胶塞；江西高科药包有限公司，批号：20150712、20150713，规格均为13.4 mm×2.0 mm；乐清市金泰实业有限公司，批号：20160402，规格：20A；山东省药用玻璃股份有限公司，批号：S160802703，规格：13-D2-3）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～9 min，90%A；9～15 min，90% A→100% A；15～50 min， 100%A；50～55 min， 100% A→90% A）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；进样量：10 μL。在该色谱条件下，BHT、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168峰的理论板数均大于2 000，保留時间分别为7.93、16.18、21.25、23.00、31.22、39.13 min；各成分峰之间分离良好，分离度均大于2.0，详见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取BHT、硫磺、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168对照品各适量，置于同一100 mL量瓶中，加入无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品贮备液。精密吸取上述混合对照品贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得BHT、流离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168质量浓度分别为0.012 96、0.013 24、0.010 31、0.013 27、0.010 64、0.012 34 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取药用卤化丁基胶塞样品剪碎，精密称取5 g，置于具塞锥形瓶中，加入无水乙醇20 mL，密塞，称定质量，于80 ℃加热回流4 h，放冷，再次称定质量，用无水乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 空白对照溶液 以无水乙醇为空白对照溶液。

2.3 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品贮备液0.2、0.5、1、2、3、5 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制成系列线性关系工作溶液。精密量取上述系列线性关系工作溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.4 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ l、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，BHT、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的定量限分别为2.073 6、2.118 4、2.749 2、1.061 6、4.436 0、3.090 4 mg/kg，检测限分别为0.628 4、0.641 9、0.833 1、0.321 7、1.344 2、0.992 4 mg/kg。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，BHT、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168峰面积的RSD分别为0.09%、0.33%、0.13%、0.18%、0.11%、0.08%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：S160802703）适量，分别于室温下放置0、3、6、12、18、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，BHT、游离硫、抗氧剂1010峰面积的RSD分别为1.78%、1.59%、1.62%（n=6），其他成分未检出，表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密称取剪碎后的样品（批号：S160802703）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，BHT、游离硫、抗氧剂1010的平均含量分别为17.6、18.5、29.6 μg/g ，RSD分别为1.11%、2.35%、1.29%（n=6），其他成分未检出，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量样品（批号：S160802703）适量，共9份，分别加入一定量的对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.9 樣品含量测定

分别取剪碎后的各批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表3（注：“-”表示未检出）。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取BHT、硫磺、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168对照品各适量，分别加入无水乙醇制成每1 mL含10 μg的单一对照品溶液，以无水乙醇为空白，于200～400 nm波长范围内扫描，结果，BHT在221、277 nm波长处，游离硫在220、264 nm波长处，抗氧剂1010在274 nm波长处，抗氧剂330在276 nm波长处，抗氧剂1076在274 nm波长处，抗氧剂168在270 nm波长处有最强吸收。另取供试品溶液和混合对照品溶液分别在220、264、277 nm波长处扫描，结果，BHT、硫磺、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168在220、277 nm波长处均有较强吸收。考虑到药用卤化丁基胶塞中的抗氧剂和流离硫含量较低，在220 nm波长处灵敏度相对较高，故选择220 nm为检测波长。

3.2 流动相的选择

本研究考察了不同体积比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相体系时的分离度。结果，以甲醇-水为流动相梯度洗脱时，各待测成分的分离度均较好，且保留时间适中，故选择甲醇-水（梯度洗脱）为流动相。

3.3 样品处理方法的确定

取药用卤化丁基胶塞样品剪碎，精密称取5 g，置于具塞锥形瓶中，加入无水乙醇20 mL，密塞，称定质量，分别以超声（30 min、1 h）和80 ℃（考虑到硫磺分子S8在高温下易分解[19]）加热回流（30 min、1 h）处理，冷却后用无水乙醇补足减失的质量，进样时发现超声处理样品的峰面积较小，与回流处理的样品相比提取不充分。另取处理后的样品进样，结果发现加热回流4 h可基本提取完全，故选择加热回流时间为4 h。

综上所述，本方法灵敏快速、操作简便、重复性好，可用于同时测定药用卤化丁基胶塞中5种抗氧剂和游离硫的含量。

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（收稿日期：2018-04-22 修回日期：2018-07-11）

（编辑：陈 宏）