观赏植物白花龙的离体快繁条件筛选

吴永清　胡秀　梁韩枝　邓莎　汤聪

摘要：[目的]筛选白花龙（Styrax faberi Perk.）的离体快繁最佳条件，为白花龙的推广种植及生态环境修复提供参考依据。[方法]以切除或带胚乳的白花龙种子为外植体、MS为基本培养基，添加不同浓度GA₃进行无菌萌发；以种子无菌萌发的茎段为外植体、MS为基本培养基，采用正交试验设计，筛选适宜白花龙丛生芽增殖培养的最佳6-BA、NAA和TDZ组合；以丛生芽增殖获得的幼苗为外植体、Ms或1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的IBA，采用直接或间接生根法，筛选白花龙组培苗生根的最佳基本培养基、IBA浓度和生根方法。[结果]带胚乳的白花龙种子在添加不同浓度GA3条件下萌发15 d后子叶开始褐化，最终全部死亡；切除胚乳的白花龙种子在无激素条件下也可萌发，但以在MS+2.0 mg/L GA3培养基中萌发率最高，达97.5%。在继代增殖阶段，白花龙丛生芽在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA培养基中增殖系数最大，为5.7。在生根阶段，带两个节的白花龙茎段在200.0 mg/L IBA溶液中浸泡15 mind转接至1/2MS空白培养基的生根率最高，达93.3%，平均生根数为7.1条。[结论]切除胚乳的白花龙种子在MS+2.0 mg/LGA3培养基中萌发率最高，其萌发的茎段在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培养基中增殖系数最大；采用间接生根法，可获得生根效率较高、适应规模化生产的白花龙组培苗。

关键词：白花龙；种子萌发；离体培养；快速繁殖

中图分类号：S685 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0536-07

0引言

[研究意义]白花龙（Styrax faberi Perk.）属安息香科（Styracaceae）安息香属（Styrax）多年生落叶阔叶灌木，主要分布于安徽、湖北、江苏、浙江、湖南、江西、广东、广西和台湾等省（区）。其树形优美，是为数不多的春季开白花、形态富有奇趣的乡土观赏树种，适用于小区、公园、道路等的绿化和边坡生态修复（金建红等，2009）。白花龙还是良好的药用和油脂用植物，果实可治疗头晕发热（陈少卿等，1982），根可用于治疗胃脘痛，种子油可制造肥皂和润滑油（中国科学院华南植物研究所，1987；中国油脂植物编写委员会，1987），叶片可用于止血、生肌和消肿（程家寿等，2011），具有广阔的开发利用前景。白花龙种壳坚硬且具有一定的休眠特性，萌发时间长、萌发率和扦插繁殖成活率低，常规的种苗繁殖方式不能满足市场需求（程家寿等，2011）。植物离体培养快速繁殖是获得大量优质种苗的有效途径（段元杰等，2016；陆荣生等，2016；王林等，2016；吴雪娟等，2016；闫海霞等，2016；Solle and Semiarti，2016；林茂等，2017；刘晓等，2017；田奥磊等，2017），因此，建立白花龙高效离体培养快速繁殖体系，对白花龙的推广种植及生态环境修复具有重要意义。[前人研究进展]安息香科植物种子普遍具有休眠特性，不能随采随播（国家林业局国有林场和林木种苗工作总站，2001），如白花树[（S.tonkinensis（Pierre）Craibex Hartw.）]的种子在常温下储藏5个月后发芽率仅20%（刘志强等，2001），激素处理配合低温层积也不能获得满意的发芽效果，如垂珠花（S. dasyanthusPerk.）经1200 mg/L GA3预处理24 h结合低温沙藏层积，发芽率仅44%（丁芳芳，2013）。王奎玲等（2010）、陈甜甜等（2017）研究发现，玉铃花（S.obassia）腋芽增殖阶段最适宜的培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，前者的增殖系数为5.56，但后者的仅为3.19。张亮亮等（2013）对白花树、王文君等（2016）对野茉莉（S. japonicus）、张琦等（2017）对赛山梅（S. confusus）的研究结果显示，MS+0.3 mg/L 6-BA是增殖阶段最适宜的培养基。在生根培养阶段，多位学者均认为适宜的基本培养基为1/2MS（王奎玲等，2010；张亮亮等，2013；王文君等，2016；张琦等，2017）。[本研究切入点]迄今，未见白花龙人工播种繁殖及离体培养繁殖的研究报道。[拟解决的关键问题]通过去除白花龙种壳以增加透气性和透水性、去除胚乳以降低萌发抑制物质和诱导幼苗褐化死亡物质含量，优化其增殖和生根培养基的激素种类和浓度配比，以提高增殖率和生根率，实现白花龙的离体培养快速繁殖，为其推广种植提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为白花龙成熟果实的种子，2015年10月采自广东省博罗县林业科学研究所林区。试验时间为2015年11月～2017年3月。

1.2试验方法

1.2.1培养基及培养条件 MS培养基中蔗糖含量30.0 g/L，琼脂含量6.0 g/L，pH 5.8～6.0。1/2MS培养基中的大量元素减半，蔗糖含量30.0 g/L，琼脂含量6.0 g/L。培养基在105 Kpa、121℃条件下高压灭菌20 min。培养温度（25±1）℃，光照强度2000 lx，光照时间12 h/d。

1.2.2種子萌发 脱去白花龙果实的果皮，将种子转至超净工作台，用75%酒精浸泡1 min，无菌水清洗1遍后剥开外种壳，放入0.1%升汞中浸泡5 min，无菌水清洗6～8遍。接种时以带胚乳和切除胚乳的种子为外植体，以MS为基本培养基，添加不同浓度（0、1.0、2.0和3.0 mg/L）GA3进行种子萌发。每处理10瓶，每瓶接种3个外植体。接种45 d后统计种子的萌发率和成苗率，观察记录苗的生长状况。

萌发率（%）=萌发外植体个数/接种外植体总数×100

成苗率（%）=成活外植体个数/接种外植体总数×100

1.2.3继代培养 以MS为基本培养基，采用L9（3⁴）正交试验设计（表1），分析6-BA、NAA和TDZ对白花龙无菌苗茎段增殖培养的影响。每处理10瓶，每瓶接种3个外植体。45 d后统计增殖系数和平均苗高，记录丛生芽的生长情况。

增殖系数=增殖后芽总数/接种外植体总数

平均苗高（cm）=增殖后苗总高度（cm）/接种外植体总数

1.2.4壮苗与生根 选取高于1.5 cm的白花龙丛生芽转接至MS+0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3培养基上培养45 d以壮苗；选择壮苗培养后生长良好的幼苗，切成带两个节的茎段用于直接或间接生根培养。直接生根培养的培养基为MS或I/2MS添加不同浓度（0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/L）IBA；间接生根培养是先将茎段置于较高浓度（100.0、200.0和300.0 mg/L）IBA溶液中浸泡15 min，再转至MS或I/2MS空白培养基中进行培养。每处理6瓶，每瓶接种5个外植体。45 d后统计平均生根数，计算生根率，记录根的生长情况。

平均生根数=根总数/接种数

生根率（%）=生根的苗数/接种数×100

1.2.5炼苗和移栽 选择健壮、侧根发达的幼苗，置于荫棚内炼苗，7 d后将幼苗移栽于泥炭土：珍珠岩：沙=3：1：1的基质中，30 d后观察植株生长情况，统计成活率。

成活率（%）=成活苗数/苗总数×100

1.3统计分析

试验数据采用SPSS 19.0进行统计，以Duncans进行多重比较分析。

2结果与分析

2.1GA₃对白花龙种子萌发的影响

由表2可知，带胚乳的种子在不添加任何激素或添加不同浓度GA3条件下，约1个月开始萌发，且萌发15 d后子叶开始褐化，最终全部死亡（图1-A），其萌发时间随GA3浓度的增加而明显缩短，萌发率呈先上升后下降的变化趋势，当GA3浓度为2.0 mg/L时，萌发率最高，但仅为20.0%；切除胚乳的白花龙种子在不添加任何激素或添加不同浓度GA₃时，一周内开始萌发，成苗率均高于80.0%，其萌发时间、萌发率和成苗率均显著高于带胚乳种子（P<0.05，下同），萌发率和成苗率随GA3浓度的增加呈先上升后下降的变化趋势，当GA3浓度为2.0 mg/L时，萌发时间最短（仅需3.0 d），萌发率和成活率最高，均达97.5%，且显著高于其他浓度处理，幼苗生长状态良好（图1-B）。说明白花龙种子胚乳中含有抑制种子萌发和导致幼苗褐化的物质，影响了胚的萌发率和萌发速度。

2.2不同激素配比对白花龙继代增殖的影响

由表3可知，培养基为0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA，即在6-BA与NAA的浓度比为10：1、且激素浓度较低时，白花龙丛生芽的增殖系数达5.7，芽长势较好（图1-C）；培养基为1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/LNAA，即调高6-BA与NAA的绝对浓度但仍保持较低比例时，增殖系数仅为4.0；而培养基为0.5 mg/L6-BA+0.01 mg/L NAA，即调高6-BA与NAA的浓度比但仍保持低绝对浓度时，增殖系数更低，仅3.3。说明增殖培养基中6-BA与NAA的浓度比及绝对浓度均较低时，可获得增殖系数较高的白花龙丛生芽。

由表3可知，白花龙丛生芽的增殖系数为2.9～5.7；高浓度（1.0和2.0 mg/L）6-BA/～导致白花龙幼苗出现玻璃化和畸形叶现象。比较极差值R，影响继代增殖的因子排序为B>A>C，即在白花龙继代增殖中发挥作用的激素排序为NAA>6-BA>TDZ。比较K值，A因子以A₁、B因子以B₂、C因子以C₂的最大，为各因子的最优水平。说明白花龙继代增殖培养的最佳激素组合为AIBzC2，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA为白花龙丛生芽增殖的最佳培养基。

2.3不同基本培养基、生根方法和IBA浓度对白花龙生根培养的影响

由表4可知，以MS为基本培养基时，白花龙的幼苗经200.0 mg/L IBA溶液浸泡1 5 min后培养45 d，虽能获得93.3%的生根率和6.3条的生根数，但无根毛产生，根的质量也一般；以I/2MS为基本培养基时，白花龙的幼苗有根毛产生，根质量好。对比白花龙直接生根法和间接生根法的效果发现，直接生根所需时间明显较长、生根率明显较低、生根数明显较少（图1-D）；间接生根法能极大缩短生根时间、提高生根率和生根数，根较粗壮。激素处理方面，白花龙幼苗在200.0 mg/L IBA溶液中浸泡15 min后接种于1/2Ms空白培养基上培养45 d，生根率为93.3%，生根数为7.1条，且有根毛产生（图1-E）。说明以1/2MS为基本培养基，使用间接生根法更适合进行白花龙生根培养，且以在200.0 mg/L TBA溶液中浸泡15 min后转接至1/2MS空白培养基上的效果最佳。

2.4炼苗移栽

用泥炭土：珍珠岩：沙（3：1：1）作基质移栽白花龙生根培养后的健壮幼苗，30 d后移栽成活率为85.0%，小苗生长状况良好（图1-F）。

3讨论

安息香科植物种子普遍含有导致种子休眠的抑制物质（国家林业局国有林场和林木种苗工作总站，2001），如垂珠花种子各部位均含有不同浓度的萌发抑制物，抑制活性排序为种胚>胚乳>种皮（丁芳芳，2013）；白花树种子的萌发抑制物主要存在于胚乳中，在其离体培养过程中切除胚乳可降低外植体的污染率，缩短发芽时间，提高成活率（张亮亮等，2013）。本研究发现，切除胚乳的白花龙种子萌发速度明显比带胚乳的种子快，说明白花龙种子的萌发抑制物也主要存在于胚乳中。張亮亮等（2013）研究发现，白花树带胚乳的种子可正常萌发并成苗，本研究的白花龙带胚乳种子萌发后约15 d开始褐化，最后整个种子坏死，说明白花龙胚乳中不仅含有萌发抑制物，还含有导致其组培苗褐化的物质。已有研究表明，高浓度ABA是导致白花树种子休眠的主要原因（吴君等，2014），层积沙藏处理（司倩倩等，2017）或GA3、NAA和6-BA等处理（许晓岗等，2012）均可打破由ABA引起的休眠。本研究以切除胚乳的白花龙种子为外植体，减少了种子中抑制萌发和导致组培苗褐化物质的含量，可加快种子萌发速度，提高萌发率，但对胚乳中萌发抑制物的具体成分及含量有待进一步探究。

本研究发现，培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA最适于白花龙丛生芽增殖（增殖系数为5.7），其中的6-BA与NAA的浓度比为10：1，而培养基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA中6-BA与NAA的浓度比同样为10：1，其芽的增殖系数仅为4.0，说明增殖系数低主要由激素绝对浓度过高引起，低比例、低绝对浓度的6-BA与NAA结合有利于白花龙继代增殖。张亮亮等（2013）、王文君等（2016）、张琦等（2017）采用6-BA（0、0.3、1.0、3.0 mg/L）与NAA（0、0.30、1.00、3.00 mg/L）组合分别对同属植物白花树、野茉莉和赛山梅进行丛生芽增殖，结果表明，当6-BA浓度一定时，随着NAA浓度的增大，增殖系数呈递减趋势；当NAA浓度一定时，随着6-BA浓度的增大，增殖系数也呈递减趋势；当培养基为MS+0.3 mg/L 6-B+0 mg/L NAA时，即6-BA与NAA的浓度比为30：0时，芽的增殖系数最高，表明低比例、低绝对浓度的6-BA与NAA有利于白花树、野茉莉和赛山梅芽增殖。本研究结果与其一致。

蒋泽平等（2005）研究发现，秤锤树的幼苗在含有高浓度（2.0 mg/L）6-BA的培养基中增殖时，幼苗出现烂心、玻璃苗现象。雷颖等（2015）研究发现，6-BA浓度越高，松潘乌头（Aconitum sungpanenseHand-Mazz.）丛生芽增殖苗的玻璃化率越高。本研究结果与上述研究结果相似，白花龙丛生芽增殖的幼苗在含有相对高浓度（1.0～2.0 mg/L）6-BA的培养基中长势不佳，也出现玻璃化现象。

以木本植物进行组织培养普遍较难生根，如马来沉香（Aquilaria malaccensis）生根培养的最高生根率仅56.7%（张卫华等，2014），但进行一定浓度的IBA处理可促进生根（Rathore and Phulwaria，2015；王婷婷等，2017；姚志红等，2017）。本研究在1/2MS基本培养基中添加1.0 mg/L IBA进行白花龙组培苗直接生根培养的生根效果最好，随着IBA浓度的增加，生根率和生根数均呈下降趋势，说明含有高浓度IBA的培养基会抑制白花龙植株根系生长，利用IBA促进木本植物生根需控制IBA的使用浓度。张亮亮（2013）采用间接生根法进行白花树生根培养的生根率比直接生根法有所提高，但仅为60.0%，生根数也仅有2.4条。本研究结果与其相似，用直接生根方式进行白花龙生根培养的生根效果也不佳，采用间接生根方法时，生根时间缩短（仅需3 d），生根率提高至93.3%，平均生根数增至7.1条，说明高浓度IBA能促进木本植物根原基形成，低浓度IBA能促使根原基伸长。

已有研究表明，矿物元素浓度较低时有利于组培苗生根（Baskaran and Jayabalan，2005）。本研究结果支持其观点，以Ms为基本培养基时，诱导的白花龙根较细弱且无根毛，以矿质元素含量较低的1/2MS为基本培养基时，诱导得到根较粗壮、有根毛、能较长时间保持较强生长势的白花龙幼苗。

4结论

本研究发现，白花龙种子胚乳中含有抑制種子萌发和导致幼苗褐化死亡的物质；切除胚乳的白花龙种子在Ms+2.0 mg/L GA，培养基中萌发率最高，其萌发的茎段在Ms+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA培养基中增殖系数最大；采用间接生根法可获得生根效率较高、适应规模化生产的白花龙组培苗。

（责任编辑 思利华）