真核表达人生长激素促进家兔生长及免疫原性分析

陈金武 齐璐璐 段莹莹

摘要 [目的]获得稳定表达重组人生长激素的中华仓鼠卵巢细胞株，并分析目的蛋白体内促动物生长活性及免疫原性。[方法]PCR扩增获得rhGH基因，构建重组表达质粒rhGH1 pOptiVEC，并进行双酶切及测序鉴定。脂质体法转染CHO/DG44 dhfr 细胞，利用SDS PAGE电泳及Western blot检测目的蛋白，并用氨甲喋呤（MTX）加压筛选阳性克隆。采用Co2+亲和层析法纯化rhGH。促去垂体家兔生长法检测rhGH体内活性，同时采用ELISA双抗夹心法检测重组蛋白诱生抗体滴度，分析其免疫原性。[结果]PCR扩增得到696 bp的rhGH序列，双酶切及测序结果显示构建的rhGH1 pOptiVEC质粒正确。转染细胞后，MTX加压使得蛋白表达量明显提高。纯化的rhGH能够促进去垂体家兔体重增加。诱生抗体滴度分析结果显示该蛋白具有与市售商品化蛋白相似的免疫原性。[结论]真核表达rhGH蛋白能够促进动物生长，可用于相关药物研究。

关键词 重组人生长激素；真核表达； 促生长活性；免疫原性

中图分类号：R335；Q291 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2018）03-071-04

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.03.029

Abstract [Objective]To construct the stable expressing vector rhGH1 pOptiVEC for recombinant human growth hormone in CHO/DG44 dhfr cells and identified the growth promoting activity and immunogenicity. [Methods]rhGH gene was amplified by PCR. The PCR product and pOptiVEC vector were digested by double enzymes. Then the two digested products were jointed together with T4 ligase. Then the plasmid was transfected to CHO/DG44 dhfr cells and the positive clones were further screened by different concentration of MTX. The target protein was purified by Co2+ affinity chromatography and analyzed by SDS PAGE electrophoresis & western blot. The body weight gain tests of hypophysectomized rabbits were carried out for potency determination of rhGH in vitro. Rabbits were immunized with rhGH and the serum antibody was also determined by ELISA.[Results]The rhGH1 pOptiVEC vector was constructed correctly， which was proved by double enzymes digestion and DNA sequencing. The positive CHO/DG44 dhfr clones could stably express rhGH with 1000 nmol/L MTX and the molecular mass of the target protein was about 23 kDa. rhGH could be purified to a high concentration（90%）by Co2+ affinity chromatography. It also could promote hypophysectomized rabbits to grow up. The antibody induced by rhGH was similar to that induced by the commercially available drug.[Conclusions]The CHO/DG44 dhfr cells which can highly express rhGH had been successfully constructed. The rhGH protein with the similar growth promoting activity and immunogenicity to the commercially available drug had been also obtained.

Key words Recombinant human growth hormone（rhGH）；Eukaryotic expression；Growth promoting activity；Immunogenicity

人生长激素（human growth hormone，hGH）是一个由191个氨基酸残基组成的非糖基化蛋白质激素[1]，分子量为22 KDa。该蛋白由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌，蛋白质分泌量一般在青春期达到最大值[2-3]。目前人生长激素主要用于治疗儿童的生长障礙和成人生长激素缺乏症（GHD），且具有良好的效果。同时，生长激素也被批准用于特纳综合症、慢性肾功能不全、儿童特发性身材矮小、烧伤烫伤手术后的恢复以及脂肪积累相关的成人脂肪代谢障碍等[4]。早期，hGH主要来自于人类尸体脑垂体，产量非常低，因此科学家尝试多种途径人工合成GH。重组人生长激素（recombi nant hGH，rhGH）是一种非天然的，由重组DNA技术生产的基因工程药物，最早由Martial等通过大肠杆菌中的原核表达而获得。因此，直到1979年开发出第一个重组人生长激素，hGH才得以进行大规模的科学研究和商业应用[5-7]。

当前国内外众多学者关注于重组人生长激素稳定表达体系的构建。一个良好的载体需要具备能促进转录与翻译的启动子，同时要确保蛋白序列的稳定性[8-9]。该次试验构建了rhGH真核表达质粒，通过氨甲喋呤（MTX）加压，在CHO/DG44细胞中成功表达rhGH。经鉴定，该蛋白具有促进动物生长活性，且具有与市售蛋白相似的免疫原性。该结果为高效表达rhGH提供试验支持，同时为rhGH在人体及动物相关疾病治疗方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

感受态细菌E.coli DH5α、中华仓鼠卵巢细胞DG44 dhfr 细胞株（CHO/DG44 dhfr ）由合肥师范学院生命科学学院保存。pOptiVEC质粒、含hGH CDS序列的质粒GC hGH1由合肥师范学院生命科学学院保存；成年家兔（雌性，1.8～2.2 kg），购自安徽医科大学试验动物中心。PrimeSTAR HS DNA ploymerase购自TAKARA公司；T4 DNA ligase、dNTPs、Nhe I、Cla I限制性内切酶、Pre stained protein Marker、Unstained protein Marker、BCA定量试剂盒、Lipofectamine 2000转染试剂、氨甲喋呤（MTX）、无血清培养基CD Opti CHOTM Medium均购自Thermo Fisher公司；DNA分子量Marker购自天根生化科技有限公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自成都福际生物公司；alpha MEM（+）、alpha MEM（-）培养基购自GIBOCO公司；胎牛血清购自HyClone公司；注射用重组人生长激素由自安科生物惠赠；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 表达载体rhGH1 pOptiVEC的构建

根据GenBank公布的hGH CDS序列设计引物，该引物由金唯智生物科技有限公司合成。上游引物rhGH1 F：5 attgctagcgccaccatggctacaggct 3、下游引物rhGH1 R：5 ttaatcgatctaatgat gatgatgatgatggaagccacagctg 3。rhGH 1 F含Nhe I酶切位点（GCTAGC）、Kozak序列、保护碱基。rhGH1 R含Cla I酶切位点（ATCGAT）、6×His Tag、终止密码子、保护碱基。

以GC hGH1质粒为模板，使用上述引物经PCR扩增获得rhGH表达片段。PCR体系：去离子水32.5 μl、5×反应缓冲液10.0 μl、dNTP Mix 4.0 μl、上下游引物各1.0 μl、模板1.0 μl、PrimeStar DNA聚合酶0.5 μl。扩增参数为：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸1 min，循环30次后72℃延伸2 min。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并用胶回收试剂盒回收。

用Nhe I、Cla I双酶切PCR产物及真核表达载体pOptiVEC。胶回收双酶切产物，用T4连接酶16℃连接过夜，再将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，用氨苄青霉素筛选阳性单克隆。对阳性克隆菌进行扩大培养，并提取无内毒素的重组质粒。经双酶切及测序鉴定后，将正确的真核表达质粒命名为rhGH1 pOptiVEC。

1.3 MTX加压建立稳定表达细胞株

1.3.1 转染CHO/DG44 dhfr 细胞 将CHO/DG44 dhfr 细胞接种于alpha MEM（+）（含10%胎牛血清）培养基中，于37℃，5% CO2培养箱培养待用。参照Lipo fectamineTM2000转染说明书，用重组质粒rhGH1 pOptiVEC转染CHO/DG44 dhfr 细胞，48 h后改用alpha MEM（-）（含5%胎牛血清）进行选择性培养，每72 h更换培养基1次，使用G418进行筛选。同时设置未转染的CHO/DG44 dhfr 细胞及转染空载体细胞为对照组。

1.3.2 亲和层析法纯化rhGH蛋白 将筛选得到的阳性细胞克隆培养2～3 d后，离心（5 000 r/min，5 min）收集培养基上清液，置于透析袋内经PEG20000吸水浓缩4 h，再参照Talon Metal Affinity Resin说明书，采用Co2+亲和层析法纯化目的蛋白。吸取适量Co2+ beads置于空柱中，待beads完全沉淀后，添加10 ml磷酸盐缓冲液平衡柱子。培养基上清倒入亲和层析柱中，垂直旋转1 h，使蛋白与beads充分结合。去塞子使上清流出，用10 ml磷酸盐缓冲液洗柱2次，去除杂质。10 mmol/L咪唑洗脱缓冲洗柱2次，去除非特异性结合蛋白。150 mmol/L咪唑洗脱缓冲洗柱，获得rhGH蛋白。将蛋白加入超滤管进行超滤，以TBS 缓冲液（Tris 3.028 g NaCl 8.766 g）为超滤缓冲液，超滤5次。最后倒置超滤，获得目的蛋白。

1.3.3 SDS PAGE电泳及Western Blot检测 采用SDS PAGE电泳法鉴定纯化的目的蛋白。然后将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），经5%脱脂奶粉封闭4 h后PBST（1×PBS + 0.1% Tween20）洗涤5次。用anti GH单克隆抗体孵育，洗涤并用HRP标记的兔抗小鼠二抗孵育。最后采用ECL法曝光顯影。

1.3.4 MTX加压获得稳定表达细胞 对培养至汇合度90%且状态良好的阳性细胞进行MTX加压筛选。MTX浓度设为：50， 100， 200， 400， 800， 1 000，1 500 nmol/L，每个浓度加压5代。待细胞在一个浓度MTX的条件下生长到汇合度达90%时更换培养基为CD Opti CHOTM Medium，72 h后收集细胞培养上清液，参照1.3.3方法检测目的蛋白表达量。将表达量最高的克隆传代培养，并进行下一个MTX浓度筛选。

获得稳定表达细胞后，采用1.3.2方法纯化目的蛋白，取少量蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测浓度，其余蛋白分装经液氮急冻再转移至-80℃冰箱保存。

1.4 rhGH促去垂体家兔生长活性分析

参照文献[10-11]，采用徒手定向穿刺法射频毁损家兔垂体，建立去脑垂体家兔模型，并于动物房精心饲养2周后备用。将处理后家兔分为3组，即阳性对照注射用重组人生长激素组、目的蛋白rhGH组、阴性对照组，每组8只，记录体重。阳性对照组、rhGH组对家兔每日1次经颈部皮下给药，剂量为40 μg/kg，连续给药5周。阴性对照组给予含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的生理盐水。

记录每只动物给药后体重与给药前体重之差即：ΔW=Wi-W0，其中ΔW为体重增重；W0为给药前体重；Wi为给药后体重。以家兔体重增重ΔW为纵坐标，给药时间T为横坐标绘制体重增重-时间曲线。三组间用t检验显著性差异，P<0.05表示有统计学意义。

1.5 rhGH免疫原性分析

参照文献[12-13]采用ELISA间接法检测rhGH诱生抗体的能力来分析rhGH免疫原性。将体重约为2.0 kg的雌兔随机分为3组，每组3只。每周一、四、日分别皮下注射给药：rhGH、注射用重组人生长激素及生理盐水，单次剂量为100 μg/kg，连续给药3周。给药后每周耳缘静脉取血1次，离心取上清。将血清用PBS稀释成1∶125、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000的滴度梯度作为一抗包被酶标板，洗涤酶标板后用BSA封闭，再用HRP-羊抗兔为二抗，OPD显色并于酶标仪490 nm检测吸收度（A490）。同时，设置空白血清孔，计算样本孔与空白血清孔的A490比值，当A490样本∶A490空白血清≥2.1，判断该样本抗体呈阳性。

2 结果与分析

2.1 rhGh1 pOptiVEC真核表达载体的构建

已知rhGH基因长度为696 bp，用1.2中引物PCR扩增后目的片段经琼脂糖凝胶电泳显示与预期结果相符（图1）。

获得的重组质粒rhGH1 pOptiVEC经Nhe I、Cla I双酶切后，琼脂糖电泳检测，得到了分别与预期载体及插入片段长度相符的2条带（图2），表明目的片段已成功插入到表达载体中。将双酶切鉴定正确的质粒送测序，结果显示序列正确。

2.2 rhGH的SDS PAGE电泳及West ern Blot检测

将转染后细胞进行无血清培养基培养。72 h后离心收集培养基上清，采用Co2+亲和层析法纯化带His标签的rhGH蛋白。纯化过程中经咪唑梯度浓度洗脱，选择最适洗脱浓度，最终选用150 mmol/L咪唑洗脱液洗脱目的蛋白。亲和层析法纯化的rhGH蛋白进行SDS PAGE电泳，如图3所示，目的蛋白分子量约为23 kDa，与预期大小一致，且纯化蛋白纯度达90%，纯化方法可用于大量蛋白提取。用anti hGH单克隆抗体对目的蛋白进行Western blot鉴定，结果如图4所示，在约23 KDa处有信号，说明纯化的蛋白为rhGH。

2.3 MTX浓度对蛋白表达的影响

用不同浓度MTX对转染细胞进行加压筛选，经蛋白纯化后对目的蛋白进行表达量分析，发现MTX浓度影响蛋白的表达。随MTX浓度增加，蛋白表达量明显升高（表1）。当MTX浓度达到1 000 nmol/L时，表达量最高，而MTX浓度进一步增大时，蛋白表达量无明显增加。因此，在转染细胞培养时，选择1 000 nmol/L MTX加压。

2.4 rhGH体内促去垂体家兔生长活性检测

由去垂体家兔净增体重-时间曲线（图5）可以得出，注射rhGH和阳性对照的去垂体家兔在6周内体重明显增加。因生长激素体内代谢较快，体内活性无法长期维持，所以给药第5周后2组家兔体重增幅减缓。注射含牛血清白蛋白生理盐水的对照组家兔在6周内体重没有明显变化。而rhGH组与阳性对照组体重增加没有明显差异，同样能显著地促进去垂体家兔体重增加。由此可见，经该次试验构建的真核表达系统表达纯化出的rhGH具有促进生长的活性。

2.5 rhGH免疫原性分析

对经rhGH蛋白免疫的家兔提取血清，在490 nm处检测检测诱生抗体的低度。以空白血清作为阴性对照，当A490样本∶A490空白血清≥2.1时，可判断该家兔产生了抗rhGH的抗体。从图6可以看出，注射了rhGH的家兔在1周后即开始产生抗体，且抗体滴度在2周后快速达到最大值。随着rhGH在体内的代谢，抗体滴度在维持一定时间后逐渐下降。rhGH与商品化的注射用重组人生长激素在抗体滴度以及维持时间方面没有明显差异。生理盐水组抗体一直呈阴性，故图中不显示。

3 结论与讨论

作为一种多肽激素，GH是调控有机体细胞生长的主要作用因子。其通过刺激体细胞的增大和数量增多，进而促进有机体所有组织的发育和增大。此外，生长激素对免疫系统的影响也受到关注。有报道称，生长激素对T细胞、B细胞、胸腺细胞、NK细胞及单核巨噬细胞等均有调节作用，并能影响IL 2、IL 2R、IFN γ和TNF α等细胞因子的分泌，与机体的免疫系统关系密切[14]。目前，hGH的基因工程产品已用于多种疾病的治疗[15-17]，但由于hGH半寿期很短，必须长期注射，这就导致病患各种各样的副作用，且费用高，在一定程度上影响其广泛的临床应用[18-19]。

在该次研究中，参照GenBank设计rhGH的扩增引物，使得表达序列带有His纯化标签，同时序列保留信号肽部分，便于细胞表达后蛋白的收集。然后将rhGH与pOptiVEC连接，构建了rhGH1 pOptiVEC真核表达质粒。该质粒上含有IRES序列，因而可以将目的基因和DHFR基因连接在一起构建双顺反子表达载体，以共同的效率和比例表达目的基因和DHFR基因。其次，该次试验选用CHO/DG44 dhfr 细胞稳定表达rhGH。该细胞在真核表达方面具有多重优势。外源蛋白在CHO细胞中能够以分泌形式釋放到培养基中，且蛋白可进行折叠、切割以及修饰加工，使得其结构和功能均与天然蛋白相似。同时，该细胞为二氢叶酸还原酶（dhfr）缺陷型，在MTX选择压力下，编码外源重组蛋白的序列片段也随着DHFR基因的扩增而扩增，大幅提高蛋白产量。文中当MTX浓度为1 000 nmol/L时，rhGH蛋白表达量达到最高。将该重组蛋白作用于去垂体家兔，可在6周内促进家兔体重增加。同时通过免疫动物，分析该蛋白免疫原性。7周内，该重组蛋白诱生抗体滴度与注射用重组人生长激素相似。以上结果表明，该次试验所建立的真核表达系统可表达出大量rhGH，且该重组蛋白无论是体内活性亦或是免疫原性，均与市售的注射用药物相似。

该次试构建的rhGH真核表达系统为大规模制备rhGH提供了一定的参考依据，也为研究hGH的各种生理功能、作用机制以及人体及家畜相关疾病的治疗奠定了基础。

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责任编辑：刘赟