黄绿苗辣椒生态型不育系的温敏性分析及杂交种子纯度鉴定

孙国胜 张昌伟 孙春青 戴忠良 马志虎

摘要：【目的】分析黃绿苗辣椒生态型不育系YBM-EAB12的温敏特性，为黄绿苗辣椒温敏特异资源的开发利用提供参考依据。【方法】将辣椒材料YBM-A2、YBM-EAB12、YBM-A2×C和YBM-EAB12×C分别进行日温/夜温为20 ℃/15 ℃、25 ℃/20 ℃和30 ℃/25 ℃诱导后置于温室种植管理，观测各材料花粉的数量及萌发率，并进行各亲本育性和形态学鉴定及种子纯度鉴定。【结果】YBM-EAB12具有温敏特性，育性转化临界温度为22.5 ℃，在低温（日均温度低于22.5 ℃）条件下表现可育，可自交结实，日均温度越低其可育程度越高，在高温（日温/夜温为30 ℃/25 ℃）条件下表现完全不育。YBM-EAB12黄叶色性状受1对隐性核基因控制。YBM-EAB12×C F2代群体分离结果表明，胞质雄性不育与不育花器官特征紧密连锁，YBM-EAB12×C F1代育性由单一核显性基因恢复，不受低温影响。【结论】黄绿苗辣椒生态型不育系具有低温可育特性，利用其进行不育系繁种，可减少不育系与保持系杂交的步骤及辣椒不育系三系制种步骤，简化繁制种子程序。

关键词： 辣椒；黄绿苗；胞质雄性不育（CMS）；温敏

中图分类号： S641.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0735-06

Temperature sensibility analysis and hybrid seed purity identification of pepper yellow-green seedling mutant

ecotype sterile line

SUN Guo-sheng1， ZHANG Chang-wei2， SUN Chun-qing1， DAI Zhong-liang1， MA Zhi-hu1*

（1Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area of Jiangsu Province， Jurong， Jiangsu 212400， China； 2College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：【Objective】Temperature sensibility of yellow-green pepper mutant ecotype sterile line YBM-EAB12 were analyzed to provide reference for the resources exploitation and utilization of thermo-sensitive characters of yellow-green pepper. 【Method】The pepper materials YBM-A2， YBM-EAB12， YBM-A2×C and YBM-EAB12×C were respectively induced under the temperature conditions where day temperature/night temperature were 20 ℃/15 ℃， 25 ℃/20 ℃ and 30 ℃/25 ℃. Then the pepper materials were planted and managed in the greenhouse. The pollen quantities and pollen germination rates of pepper materials were observed； fertility of parents was researched. Morphological identification and seed purity identification were also conducted. 【Result】YBM-EAB12 enjoyed temperature sensibility. The critical tempe-rature of fertility transformation for YBM-EAB12 was 22.5 ℃. Under low temperature conditions（daily average temperature was below 22.5 ℃）， YBM-EAB12 was fertile and self-fertile. The lower daily average temperature，the higher fertility. But under high temperature conditions（day temperature/night temperature was 30 ℃/25 ℃）， YBM-EAB12 was completely sterile. The trait of yellow leaf were controlled by a pair of recessive nuclear gene. According to YBM-EAB12×C F2 population segregation results， cytoplasmic male sterility（CMS） was tightly linked to the organ characteristics of sterile flower. The fertility of YBM-EAB12×C F1 was restored by mononuclear dominant gene and was not affected by low temperature. 【Conclusion】Pepper yellow-green seedling ecotype sterile line has the characteristic of fertility under low temperature. Breeding the sterile line with pepper yellow-green seedling ecotype sterile line can reduce the step of hybridization between sterile line and maintainer line，reduce seed production step of third-line breeding in pepper sterility lines. It simplifies seed production procedure.

Key words：pepper； yellow-green seedling； cytoplasmic male sterrility（CMS）； temperature sensibility

0 引言

【研究意义】辣椒（Capsicum annuum L.）是世界范围内栽培最广泛的驯化种（Wang and Bosland，2006），我国每年约栽培140万ha。辣椒人工制种（通过人工去雄制种或雄性不育系制种）是目前我国乃至世界范围内的主要杂交制种手段（Berke，2000；Lee et al.，2010），其耗时长、工作量大、成本高，同时由于去雄不彻底存在杂种纯度低等风险。雄性不育系的开发利用可提高杂交种子纯度，降低人力工作量和制种成本（杨朝进等，2008）。黄绿苗辣椒生态型不育系YBM-EAB12是以黄绿苗辣椒YBM与辣椒胞质雄性不育系选育而成，具有叶色黄绿及雄性不育的特性，但在日均温度低于22.5 ℃时转变为可育，或不育不完全，影响种子质量。因此，分析黄绿苗辣椒生态型不育系的温敏特性，对确定温敏雄性不育辣椒材料育性转化临界温度和转化时期及温敏辣椒资源和辣椒两系法育种技术的推广应用具有重要意义。【前人研究进展】植物雄性不育主要分为细胞核雄性不育和胞质雄性不育，已在水稻和辣椒杂交制种中广泛应用（邹学校，2009）。与细胞核雄性不育相比，胞质雄性不育无自花授粉机会，其后代100%不育，可省略田间去杂程序，极大降低杂交制种成本，确保种子纯度（Dhaliwal and Jindal，2014）。杨仕华等（2009）研究认为，我国水稻两系法制种已大规模应用于杂交水稻生产。马志虎等（2001，2005）研究发现，将黄绿苗辣椒作为隐性核单基因黄叶色遗传标记应用于F1代种子的纯度鉴定耗时较短，可靠性极高，且利用黄绿苗辣椒材料已成功选育出辣椒品种镇椒八号和黄绿苗辣椒胞质雄性不育系。Ma等（2015）研究表明，黄绿苗辣椒YBM-12A株系在江苏秋播时表现雄性可育或部分可育，低温可诱导出>50%的可育株，在甘肃张掖和酒泉7～8月进行杂交制种时，其育性表现十分彻底，F1代种子纯度达100%；经对YBM-12A多代定向选育，育成黄绿苗辣椒生态型雄性不育系。Ma等（2016）开展黄绿苗辣椒的黄化机理研究，通过对黄绿苗辣椒突变体进行雄性不育转育，育成了黄绿苗甜椒胞质雄性不育系和叶用型黄叶辣椒胞质雄性不育系。【本研究切入点】目前，针对黄绿苗辣椒突变体生态型不育系温敏特性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】分析黄绿苗辣椒生态型不育系及其F1代花粉育性的温敏特性，观测二者及其F2代分离群体花器官的形态，采用形态标记法和生长试验（GoT）对不同区域繁制的F1代进行纯度鉴定，为黄绿苗辣椒温敏特异资源开发辣椒两系法（剔除保持系）育种方式提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

黄绿苗辣椒胞质雄性不育系YBM-A2（A）、生态型雄性不育系YBM-EAB12（AB）、恢复系tp12-36（C）、YBM-A2×C杂交一代（AC）、YBM-EAB12×C杂交一代（ABC）和YBM-A2×C杂交一代自交（AC）由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所提供。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 温度诱导 于人工生长箱模拟自然温度和光照日变化对YBM-A2、YBM-EAB12及其 F1代（YBM-A2×tp12-36和YBM-EAB12×tp12-36）进行3个不同温度处理，日温/夜温分别为20 ℃/15 ℃、25 ℃/20 ℃和30 ℃/25 ℃，白天光照为模拟自然光，夜晚为黑暗。每个温度处理（A、AB及其F1代AC和ABC）均为20株。于幼苗期（8片真叶）开始进行温度诱导，10 d后置于温室进行生长状况观察。每处理3次重复。

1. 2. 2 花粉數量及萌发率测定 花粉数量参照叶正文等（2010）、Ma等（2013）的方法进行测定，将100个未开裂的花药放入10 mL离心管置于35 ℃烘箱中干燥，待花粉完全散出后加入1%六偏磷酸钠溶液4 mL，定容至5 mL，在漩涡振荡器上振荡成悬浮液；用微量移液管吸取1 μL悬浮液滴于载玻片上，在倒置生物显微镜下观察，统计花粉粒数量，重复5次，取每枚花药花粉量（N）5次测定值的平均值，N=载玻片上的花粉总数×5000/100。花粉阴干后播于固体培养基（0.01%硼酸+10%蔗糖+1%琼脂）上，25 ℃暗培养（叶正文等，2010）6 h后统计花粉萌发率。 每处理随机观察6个视野，以花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发。

花粉萌发率（%）=已萌发花粉数/花粉总数×100

1. 2. 3 育性及形态学鉴定 在黄绿苗辣椒开花期，随机选取生态型不育系及F1代（YBM-EAB12×tp12-36）的5朵花，参照Gulyas等（2006）的方法鉴定花粉育性，同时将F1代进行自交获得F2代，观测、统计、分析其分离群体和花器官（雄蕊和花瓣）的形态。

1. 2. 4 种子纯度测定 2013～2016年，分别在江苏镇江、云南元谋和甘肃张掖进行杂交制种，组合分别为YBM-A2×tp12-36和YBM-EAB12×tp12-36，制种期日均气温22～28 ℃，共得到杂交种6份，胞质雄性不育系不同区域杂交一代种子编号为AC-zj（镇江）、AC-ym（元谋）和AC-zy（张掖）；生态型不育系不同区域杂交一代种子编号为ABC-zj（镇江）、ABC-ym（元谋）和ABC-zy（张掖）。种子纯度采用GoT和苗期形态标记法进行测定。每份杂交种随机选取200粒饱满种子，浸种后用透气毛巾包好于28～30 ℃保湿催芽，期间每天用20～25 ℃温水冲洗2次（时间分别为8：00和17：00）。待种子萌发后播于穴盘，置于温度25～28 ℃、相对湿度45%～60%的标准温室，每天给予16 h光照和8 h黑暗。幼苗子叶出土后3 d或具两片真叶时进行叶色遗传标记纯度鉴定，F1代纯度（%）=绿苗数/总苗数×100；苗期形态标记经纯度鉴定后，待幼苗具8～11叶真叶时定植于大田进行GoT，待挂果后依据果实及植株特征进行纯度测定，F1代纯度（%）=符合F1代特征植株数/总株数×100。重复3次。

1. 3 統计分析

试验数据采用Excel 2006进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 黄绿苗辣椒胞质雄性不育系、生态型雄性不育系及其F1代的花粉数量和萌发率

由表1可知，YBM-A2和YBM-EAB12均在低温条件下发生了育性转变，育性变化与温度存在直接关系；YBM-A2和YBM-EAB12的育性在22.5 ℃（育性变化温度临界点）发生逆转，平均温度越低其可育程度越高。其中，YBM-EAB12的可育花粉数量随温度的降低而迅速增加，可育花粉萌发率也随之猛增，且二者的变幅远高于YBM-A2。YBM-EAB12×tp12-36的F1代平均可育花粉数量和可育花粉萌发率在不同温度处理间均无明显差异，说明其花粉育性不受低温（15～25 ℃）或高温（20～30 ℃）的影响。

2. 2 黄绿苗辣椒生态型不育系的形态学鉴定

由表2可知，在春季表现不育的YBM-EAB12花器较小，花药窄小呈箭头状，无花粉粒或有极少无活性花粉粒，花柱（4.8 mm）也短于可育花花柱（5.0 mm），柱头略粗；花瓣长/宽为14.0 mm/7.5 mm，开张度≤60°，且均小于正常花；花丝变短变细，颜色发白，花丝长3.0 mm，粗0.25～0.50 mm；蕾期花药为紫色偏深，麦粒状偏尖。在秋季表现可育的YBM-EAB12花瓣长/宽为15.0 mm/9.0 mm，开张角度近90°，花丝长4.2 mm，花丝粗0.50～0.70 mm，蕾期花药颜色淡紫发黄，麦粒状，雌蕊育性正常（图1）。说明黄绿苗辣椒生态型不育系材料在春季和秋季冷凉条件下花器官的表现存在差异。

田间观察发现，采用形态标记法标记的黄绿苗辣椒生态型不育系F1代（YBM-EAB12×tp12-36）新生和老叶叶色均为绿色，花器官可育。由表3可知，F2代群体分离结果为可育（花正常）∶不育（花皱缩）=3∶1[观察发现不育株花器官均表现为雄蕊不育，无花粉，花瓣皱缩，开张度小，与可育株区别明显（图2）]；叶色分离结果为绿色∶黄色=3∶1。说明YBM-EAB12×tp12-36的F1代育性由1对核显性恢复基因控制[χ2（0.028 df=3）<χ20.05，3=7.82]。

2. 3 种子纯度鉴定结果

由表4可知，采用GoT的纯度鉴定结果与苗期形态标记纯度鉴定结果高度一致，相关系数达0.98，说明苗期形态标记纯度鉴定的种子纯度与GoT鉴定的种子纯度呈高度线性正相关。由表4还可看出，YBM-A2×tp12-36的F1代种子纯度在97.50%～99.67%，YBM-EAB12×tp12-36的F1代种子纯度在99.67%～100.00%，YBM-EAB12×tp12-36的F1代纯度略高。

假杂种（自交授粉/温敏有粉）可在齐苗后正确鉴别，且纯度鉴定结果也与GoT纯度鉴定结果高度一致。苗期形态标记纯度鉴定所需时间为出苗后8～15 d（图3），而GoT纯度鉴定直至所有农艺性状全部表现出来才能进行鉴定，所需时间为出苗后90～150 d，远长于苗期形态标记纯度鉴定。

3 讨论

胞质雄性不育是由不育系A（Srfrf）与保持系B（Nrfrf）杂交产生的后代，植株100%不育，对温度敏感的胞质雄性不育系统，A系可在低温条件下自我保持，在高温条件下表现不育，当温度低于22.5 ℃时，表现为可育，且平均温度越低育性程度越高，其可育花粉数量和花粉萌发率随温度的降低而增加，可能与可育花粉数量和花粉萌发集团效应有关（Dhaliwal and Jindal，2014）。本研究结果表明，在低温条件下，黄绿苗辣椒胞质雄性不育系YBM-EAB12的育性很容易受到诱导，且存在株系间差异，与已有的研究报道（Shifriss，1997）一致。在水稻（曾汉来等，1996）中发现的温敏型不育系育性转变温度为26.0 ℃，高于26.0 ℃表现为可育，低于此温度表现为不育，本研究结果与其相似。

本研究中，黄绿苗辣椒生态型不育系材料春季不育花器官的形态与秋季可育花器官表现不同，同一植株上春季花的形态表现为不育材料形态，典型性状为花药窄尖、花瓣皱缩，花瓣开张度≤60°，而秋季的典型性状为花药较饱满，花瓣平展，花瓣开张度近90°，可判断黄绿苗辣椒生态型不育基因与花器官的形态紧密连锁；将黄绿苗辣椒形态标记与生态不育相结合，可减少杂交种子纯度鉴定时间，且苗期形态纯度鉴定与GoT纯度鉴定结果高度一致。形态标记以其直观、可信度高为商业化种子生产所接受，如在番茄和马铃薯中发现的花青素缺失突变体和叶色突变体已得到利用（Georgiev，1991），Ilbi（2003）的研究也表明，苗期形态标记可用于检测杂交种子纯度，无需进行GoT鉴定。

唐文邦等（2011）研究发现，黄绿苗辣椒生态型不育系对育性转换温度敏感，不易产生育性漂变而影响制种安全。本研究观察发现，黄绿苗辣椒生态型不育系YBM-EAB12在甘肃酒泉和张掖夏播时表现雄性不育，制种时期日均温度在22.5 ℃以上，日均最低温度大于14.0 ℃，日均最高温度28.0 ℃，其不育花器官的形态特征表现与原不育系相同，而镜检及杂交F1代纯度检测结果表明其不育性十分彻底，说明用生态型不育系配制的辣椒组合育性不受温度影响，可很好地展现黄绿苗辣椒生态型不育系的特点，且黄绿苗辣椒生态型不育系与恢复系的异交结实率高，无水稻两系法制种过程中产量较低、制种成本高的缺点（斯华敏等，2011），可用于低成本生产辣椒杂交种子。

4 结论

黄绿苗辣椒生态型不育系通过生态区温度变化将自身变为保持系，简化了制种过程，是对传统辣椒育种技术的一次革新；将辣椒苗期黄绿叶色标记为苗期形态鉴定性状，可简化种子纯度鉴定程序。

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（責任编辑 思利华）