不同鸡种BF1基因SNP和Indel比对分析

陈博雯 郑圣晗 张莘 王统苗 王志秀 张扬 陈国宏 常国斌

摘要：鸡BF1基因多态性与传染性疾病的抗性有很大关系。鸡BF1基因多态性及功能尚不清楚。本研究直接测定了25个鸡种BF1基因序列，并与从NCBI下载的红色原鸡BF1基因进行了比较，构建系统进化树进行分析。结果显示，在这25个鸡种中共检测到了171个单核苷酸多态性（SNP），其中外显子上发现了108个SNP。这些外显子中SNP位点编码氨基酸166个，其中有58个氨基酸发生变异，氨基酸序列同源性高于核苷酸。外显子4和外显子1的SNP数量最多，占46010以上，第5、第6、第7、第8外显子属于保守区域。核苷酸序列缺失主要发生在外显子1和内含子5上。25个鸡种根据地理位置和气候环境大致可被分为3大类。说明，BF1基因在核苷酸多态性水平上存在较高的变异性，为鸡抗病育种提供了基础。

关键词：鸡MHC; BF1基因;SNP; INDEL

中图分类号：S858.31

文献标识码： A

文章编号： 1000-4440（2018）05-1087-08

主要组织相容性复合体（MHC）在所有有颌脊椎动物的免疫系统中具有重要作用。在鸡中，MHC-B区域编码经典的I类和II类分子，它是最具多态性的基因组区域，主要编码参与先天和适应性免疫反应的蛋白质，因此，该基因组区域对于机体抗病性和易感性至关重要。

在哺乳动物的免疫系统中，细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）对于病毒感染以及肿瘤等疾病的免疫与治疗方面有其不可或缺的地位。当一个抗原被识别后，将被分解成若干个多肽分子。MHC，类基因编码的分子与细胞表面病原体衍生的多肽链结合，使细胞表面显示出病原体，CTL通过其细胞表面的T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别呈递的抗原表位，从而对病原体细胞进行杀伤并诱导免疫应答。鸡MHC主要有3个亚区，即BF（I类）、BL（II类）、BG（Ⅳ类）。鸡几乎所有的细胞均表达BF基因，BF抗原在MHC限制性抗原呈递给细胞毒性T细胞过程中起核心作用。大多数鸡MHC单倍型含有2个经典的I类基因座，BF1和BF2。且有研究结果表明，BF1在靶细胞上表达的分子能够强烈抑制鸡NK细胞的杀伤。可见，BF1在鸡体免疫应答中发挥着极为重要的作用。

鸡MHC位于第16号微小的染色体上，其中BF1基因位于DMB2和TA P1基因之间。有研究者指出，鸡马立克病的抗病性在很大程度上由基因决定，而鸡MHC基因多态性与这种传染性疾病的遗传抗性高度相关，所以抗病育种在疾病控制方面发挥着越来越重要的作用。由于BF1基因在其他鸡品种抗病性的研究甚少，尚不了解不同鸡种BF1基因之间的差异。本研究利用目标区域捕获测序技术对25个鸡品种外周血淋巴细胞（Peripheralblood leukocytes，PBLs）中BF1基因序列进行测定，分析其SNP位点和Indel位点，找出不同鸡种BF1基因序列上的差异，初步探讨BF1基因在不同鸡品种中的遗传多态性及其进化机制，也为鸡抗病育种工作的研究提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集25个不同鸡品种的血样，选取的25个鸡种分别为，来自扬州大学动物科学與技术学院遗传资源实验室的雪山鸡、青脚麻鸡、广西黄鸡、文昌鸡、溧阳鸡、太湖鸡、AA鸡、罗斯鸡、安卡鸡、隐性白羽肉鸡、如皋黄鸡和东乡绿壳蛋鸡，来自中国农业科学院家禽科学研究所国家地方禽种资源基因库的泰和乌骨鸡、大骨鸡、仙居鸡、北京油鸡、白耳鸡（BE）、鹿苑鸡、斗鸡、茶花鸡、固始鸡、藏鸡、狼山鸡和萧山鸡，来自云南省野生动物救护中心的红色原鸡亚种。

每个鸡种选取10个样本，并通过翅静脉采集血液样品l ml，保存在4 cC中。试验采取苯酚和氯仿从血液中提取DNA。将同一品种10只鸡的混合DNA样品送到深圳华大基因公司进行目标序列捕获测序，选择Gallus_gallus-5.0作为参照基因组。高通量测序DNA样本的范围为鸡16号染色体，位置为41803～139165，共计97363 bp。参考序列为红色原鸡的基因序列。GenBank登录号为693260。

1.2 序列分析

从测序的DNA序列中选择BF1基因，利用MEGA6.06软件对25个鸡种的基因序列进行比对分析，统计核苷酸突变位点，及与之相对应的氨基酸突变位点和插入位点。构建系统进化树并进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 NCBI网站检索Gallus gallus的BF1基因序列

BF1基因位于第16号染色体上的87140～89907位置。BF1基因总长2 768 bp，其中CDS区长为1083bp。在NCBI网站上检索出Gallus gallus的BF1基因外显子和内含子情况如图l所示。图l显示BF1基因由8个外显子和7个内含子组成。

2.2 不同鸡种BF1基因的SNP位点和Indel位点分布

通过GenBank数据库对8个外显子和7个内含子进行鉴定，确定其相对位置。每个外显子和内含子的SNP数目见表l。

与参考序列相比，25个鸡种中BF1基因共有171个单核苷酸多态性。BF1基因外显子中共有108个SNP，突变个数明显多于内含子，说明外显子更具多态性。

由表l知，SNP主要发生在外显子l和外显子4上，其中外显子4上有50个SNP，外显子1次之，而外显子5、外显子6、外显子7、外显子8上没有出现突变，说明这些外显子区域比较保守。

表2中的“长度”表示不同鸡种BF1基因的长度，由于BF1基因存在插入和缺失，鸡种BF1基因长度不同。通过分析发现插入和缺失主要发生在外显子1和内含子5上。从表2中可以看出，与原鸡序列相比，不同的25个鸡种BF1基因序列都有核苷酸的缺失，其中AA鸡、罗斯鸡和安卡鸡这些外来种发生核苷酸缺失最多，斗鸡的核苷酸缺失最多达29个，狼山鸡、绿壳蛋鸡和茶花鸡等地方种发生核苷酸缺失较少。大部分鸡种BF1基因在外显子l上都发生了较大片段的缺失，而大骨鸡和固始鸡BF1基因没有核苷酸的缺失和插入以及单核苷酸突变（表3和表4），表明这2个鸡种在BF1基因上具有保守性。

对于BF1基因.25个鸡种中外显子l上G/C突变发生较多，且都是非同义突变（V/L），其他都是同义突变。由表l知，外显子l的核苷酸序列发生缺失，这些缺失也导致氨基酸缺失。在外显子2和外显子3上，这些鸡种中分别有2个SNP位点为非同义突变，每个核苷酸突变导致相应的氨基酸变异。外显子4中C/T突变最多，且都是非同义突变。这些外显子中SNP位点编码的氨基酸有166个，其中有58个氨基酸发生了变异，表明氨基酸同源性高于核苷酸。

从表4中可以看出，不同鸡种BF1基因外显子4上有10个突变位点，核苷酸突变位点最多，其次是外显子1，表明这2个外显子区域具有丰富的多态性。

单核苷酸多态性存在于所有种中，25个鸡种的外显子中斗鸡数量最多，氨基酸缺失数也最多。

2.3 BF1基因的MEGA系统进化树分析

利用MEGA6.06对25个鸡种的BF1基因进行对比分析，选用Construct/Test Neighbor-Joining Tree（NJ）方法构建系统进化树（图2），Bootstrap的值设置成500。25个鸡种根据其地理位置和气候环境，大致可被分为3大类，文昌鸡和雪山鸡等聚为一类;斗鸡、乌骨鸡和鹿苑鸡聚为一类;广西黄鸡单独为一类。上述结果表明，BF1基因在进化过程中存在丰富的遗传多样性。

3 讨论

本研究报告了鸡BF1基因在25个鸡种中的SNP以及Indel情况。如果只考虑外显子中发生的SNP个数，可以发现高变区外显子4上的SNP数量最多，其突变比例在44%以上，相对应氨基酸突变数目和突变位点也最多，由此可以推测外显子4在BF1基因中起决定性作用，决定着BF1基因的遗传多样性，可能存在与疾病有关的变异，这一发现需要进一步验证。而外显子l上检测到的单核苷酸多态性大部分是非同义替换，编码的氨基酸没有特定的差异，所以氨基酸水平上基本是保守的或半保守的。基于這些特征，Shiina等报道，这种高度多态性似乎只能部分影响表达分子的结构，而间接选择可能是基因变异的主要驱动力。

本研究发现斗鸡外显子中的SNP数目最多，茶花鸡、大骨鸡和文昌鸡等发生SNP数目较少，固始鸡外显子中没有SNP，这与研究报道的中国斗鸡的遗传多样性丰富，固始鸡因其独特的特征特性和相对封闭的形成历史具有较好的保守性的研究结果相吻合。

在系统聚类中，25个鸡种分为3大类，但不同种间置信度水平并不高，这是由于该基因变异度高导致不同鸡种之间的同源性低，这可能与中国地方多种生态类型、种群演变历史以及丰富的遗传多样性有关，例如观赏性的河南斗鸡、药用的乌骨鸡等;广西黄鸡单独为一类，表明广西黄鸡BF1基因为单独起源，又因其分布于广西壮族自治区，属于放牧饲养，整个鸡群的生长都处在大自然状态之下，生存能力和抗病性强：大骨鸡，萧山鸡等其他21个鸡种分为一类，其中罗斯鸡与隐性白羽肉鸡作为现代主要肉鸡品种，具有生长速度快，饲料报酬高的特点，但同时也存在抗病力尤其是先天免疫性能相对较差的问题，BF1基因上SNP位点的缺失可能是影响因素之一。

鸡的MHC多态性与疾病的抗性相关，如抗马利克病（Marek's disease，MD）。依照分子拟似学说，某些个体对疾病的易感是由于病原体的抗原结构与MHC分子相似，致使免疫系统无法识别，不能有效攻击病原体，由于多态性的存在使这种“拟似”受到限制，从而使病原体不能在群体中大面积传播。本研究比对分析了25个鸡种BF1基因的序列，充分显示了鸡BF1基因丰富的多态性，它为基因改造提供了丰富的资源，为更多疾病控制提供了候选基因。因此，研究鸡BF1基因多态性对于研究鸡抗病性和易感性具有不可或缺的作用。