康艾注射液对乳腺癌组织中PI3k/akt通路和CD、NK细胞的影响

王红兵 蒲志忠 邓彬 雷霄

摘要目的：觀察康艾注射液在提高乳腺癌癌患者的临床疗效及其免疫力方面的机制，探讨其对PI3k/akt通路的影响。方法：选取2016年1月至2017年9月重庆市开州区人民医院收治的乳腺癌患者90例，采取随机数字表法分成对照组和观察组，各45例。2组均给予乳腺癌相关的基础治疗和化疗，观察组此基础上予以康艾注射液治疗，比较2组治疗的临床疗效、免疫指标、临床受益情况并分析对PI3k/akt通路的影响。结果：治疗后临床有效率观察组和对照组分别为8623%，6811%，差异有统计学意义（P<005）；治疗前2组免疫功能差异无统计学意义（P>005），治疗后观察组免疫功能指标有提高，差异有统计学意义（P<005），但对照组无明显改变，差异无统计学意义（P>005）；观察组临床受益情况（KPS和体重变化的稳定率和改善情况）均明显比对照组优，差异有统计学意义（P<005）；与治疗前比较，2组治疗后各时间节点的PI3K、pAKT、bcl水平均下降，差异有统计学意义（P<005），而bax水平则升高，差异有统计学意义（P<005），但是，各时间节点PI3K/AKT信号通路标志性蛋白水平的变化趋势，对照组比观察组更明显，差异有统计学意义（P<005）。结论：康艾注射液可明显改善乳腺癌患者疗效，是通过提高其免疫水平来实现，其中与PI3k/akt通路的介导有密切关联。

关键词康艾注射液；乳腺癌；PI3k/akt；信号通路；CD；NK细胞；免疫系统；分子生物学

Effect of Kangai Injection on Expression of PI3k / akt in Breast Cancer Tissue and Its Effect on CD and NK Cells

Wang Hongbing， Pu Zhizhong， Deng Bin， Lei Xiao

（Department of General Surgery， People ′s Hospital of Kaizhou District， Chongqing 405400， China）

AbstractObjective：To observe the mechanism of Kangai injection in improving the clinical efficacy and immunity of breast cancer patients， and to explore its effect on PI3k / akt pathway. Methods：From January 2016 to September 2017， 90 patients with breast cancer who were received by our department were divided into control group and observation group by random number table method， with 45 patients in each group. The two groups of patients were given breast cancerrelated basic treatment and chemotherapy， and the observation group was added Kangai injection treatment. The clinical efficacy， immune indicators， clinical benefit and of PI3k / akt pathway of two groups were analyzed. Results：1）The clinical effective rates of the two groups were observation group 8623% and control group 6811% （P<005）； 2）immune function indicators of the two groups before treatment were not comparable （P>005）. 3）The clinical benefit （KPS and the stability and improvement of KPS） were observed in the observation group， and the difference was statistically significant （P<005）. The level of PI3K， pAKT and bcl in the two groups were decreased at all time points after treatment （P<005）， and the level of bax was increased （P<005）. However， the trend of marker protein concentration of PI3K / AKT signal pathway was significantly higher in the control group than in the observation group （P<005）. Conclusion：Kangai injection can significantly improve the efficacy of breast cancer patients， which is achieved by improving its immune level. And it is closely associated with PI3k / akt pathway.

Key WordsKangai injection； Breast cancer； PI3k / akt； Signal pathway； CD； NK； Immune system； Molecular biology

中图分类号：R2895；R7302文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.026

随着人们生活节奏的加快和社会竞争的日益剧烈，生活和工作的巨大压力容易导致一些亚健康甚至是疾病的产生，其中女性的健康和生命质量日益受到关注，近年来最为明显也最广受关注的就是乳腺增生，其发病率高达60%[1]。乳腺增生不一定会有明显临床表现，最普遍的是乳房胀痛，尤其是月经来前，容易受到忽视。乳腺增生未及时治疗容易进展为乳腺癌，乳腺癌近年来的发病年龄也越来越小，通常是采取手术切除的方式，虽然效果显著，但也确实严重影响患者的生活[2]。中医学对乳腺癌并无明确的中医学病名，早在几千年前的传统古医学书籍《外科正宗》就明确指出，乳腺癌即乳痹，多为忧郁郁结，转于肝、思重伤及脾，随后伤心，经络阻塞不同，随后聚集于核[3]。因此，免疫力低下中，肝气郁结是乳腺癌发病中最关键的一个环节，同时，乳腺癌也是机体免疫力低下的重要信号。康艾注射液含有各种免疫活性成分，通过调节或提高机体免疫水平而对癌细胞有一定抑制或抵抗作用，且不良反应小[4]。本研究采用康艾注射液对90例乳腺癌患者进行治疗，现报道如下。

1资料与方法

11一般资料选取2016年1月至2017年9月收入我科的乳腺癌患者90例，男女患者各45例，年龄42～74岁，平均年龄（452±71）岁，住院时间8～13 d，平均住院时间（100±20）d。以随机数字表法分为对照组和观察组，各45例。2组在性别、年龄、疾病时长、乳腺癌癌肿分型、癌细胞转移情况以及受教育程度等比较，差异无统计学意義（P>005），具有可比性。见表1。本研究是否经伦理委员会批准（伦理批件号2938294DW）

表12组一般情况比较组别男/女（例）年龄（±s，岁）病程（±s，d）观察组（n=45）22/23453±41110±19对照组（n=45）23/22466±38109±20χ2/t4784316322P008603450235

12诊断标准西医的诊断标准：1）采用《中国常见恶性肿瘤诊治规范》以及欧洲临床肿瘤协会年会（EsMO）中提出的关于乳腺癌的诊疗标准[56]；2）行病理检查确定为乳腺癌者；3）Kanoarfly评分超过60分。中医诊断标准：参照《中医乳腺癌诊断学》中乳腺癌肝郁气滞型中的相关证候标准[7]。

13纳入标准1）符合12诊断标准者；2）年龄40～55岁；3）在本研究前的1个月内没有采用过与本病相关的治疗，比如紫杉醇化疗、手术根除治疗等措施，并无大手术经历；4）所有入选患者及家属均知情同意，并签署知情同意书。

14排除标准1）严重心、肝、肾脏功能异常者；2）血小板计数<10×109/L者；3）伴有严重感染者或治疗过程中有严重不良反应出现；4）妊娠期、哺乳期妇女；5）精神障碍或语言沟通不畅者；6）中药不耐受者或药物过敏。

15脱落与剔除标准1）在研究期间使用治疗方案以外药物者；2）在治疗过程中因故中途退出或随访中自然脱落者；3）不配合本研究的干预治疗措施，影响研究进行者；4）在研究过程中出现严重不良反应或并发症者。

16治疗方法2组均给予乳腺癌相关的基础治疗和化疗：补液、营养支持、纠正电解质紊乱、白蛋白及止痛等对症治疗等，此外予以化疗：紫杉醇（哈尔滨莱博通药业有限公司，国药准字H20067522）150 mg/m2和顺铂（齐鲁制药有限公司，国药准字H20023460）40 mg/m2各加入到5%葡萄糖注射液250 mL，静脉滴注。观察组在对照组基础上加用康艾注射液（由北南康艾抗癌制药有限股份公司，生产批号：H17384190）50 mL，规格：10 mL/支，主要组成：人参、黄苠和苦参素等。该注射液需加入到09%氯化钠注射液500 mL进行静脉滴注，1次/d，在化疗后静脉滴注，共治疗14 d。

17观察指标

171免疫功能综合评价免疫功能的检查我们采取查CD3+（总T淋巴细胞）、CD4+（辅助T淋巴细胞）、CD8+（抑制/细胞毒T淋巴细胞）和自然杀伤（NK）细胞，具体方法：由专门培训过的技术人员，采取由江苏常州医疗公司提供的专业试剂盒，以及流式细胞仪测定[8]。注意先抽取患者清晨空腹的手肘静脉血15 mL，在室温凝固之后，以3 500 r/min离心20 min，再用相关仪器测定。

172乳腺癌组织中磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PI3K/ Akt）信号通路标志性蛋白测定将术后的乳腺癌组织标本通过采取DAB方法，提取癌组织的蛋白液，测定其他水平后以100 μL蛋白液中加入25 μL的上样缓冲液，置于100 ℃的蛋白中变性，然后提取上量，120 V，50 mA，15 h，电泳后，用4%浓缩胶进行1次12%分离后提取凝胶，转印聚偏氟乙烯（PVDF）膜，遵循胶在负极，膜在正极的原则，50 V，100 mA，2 h，用磷酸盐缓冲液（TBS）洗脱15 min，共3次，分别加入5%脱脂奶粉按1∶1 000稀释的抗PI3K、pAkt、B淋巴细胞瘤2（Bcl2）、细胞凋亡促进基因（Bax）和βactin抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBS再如上述所为，加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG（1∶2 000）室温2 h，重复操作TBS洗脱。图片处理，由美国BDIENGDEIGN公司提供的Model BDEDENGJ 200进行处理。

注：治疗前为T0，治疗后5 d、8 d、10 d及14 d分别为：T1、T2、T3及T4。

18疗效判定标准全面的疗效判定标准需参照由视觉模拟评分法（VAS）进行评价的止痛效果标准，即评价治疗前后疼痛缓解情况[9]：癌痛痊愈：乳表22组癌痛止痛效果比较组别癌痛痊愈（例）显效（例）有效（例）无效（例）有效率（%）观察组（n=45）9141578623对照组（n=45）81012156811χ2428P0022

腺癌肿的癌痛完全消失，VAS评定为完全缓解（CR），大小便、睡觉、饮食等生活均正常；有效：疼痛程度较前有较大程度的缓解，VAS评定为部分缓解（PR），大小便、睡觉、饮食等生活均有明显好转；显效：VAS评分定位轻度缓解（MR），癌肿的癌痛稍有减轻但减轻程度不明显，大小便、睡觉、饮食等生活均仅是稍微改善；无效：乳腺癌癌痛一点也未改善甚至较前加重，VAS评分定无效（NR），大小便、睡觉、饮食等生活均无改善甚至加重[10]。

19统计学方法应用SPSS 230统计软件分析本研究的数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本均数采用t检验，等级资料进行秩和检验，计数资料进行χ2检验，以P<00为差异有统计意义。

2结果

212组临床疗效（癌痛止痛效果）比较治疗后2组临床有效率观察组和对照组分别为8623%，6811%，差异有统计学意义（P<005）。见表2。

222组免疫功能比较治疗前2组免疫功能比较，差异无统计学意义（P>005），治疗后观察组免疫功能指标提高，差异有统计学意义（P<005），但对照组无明显改变，差异无统计学意义（P>005）。见表3。

232组临床受益情况比较观察组临床受益情况（KPS和体重变化的稳定率和改善情况）均明显比对照组优，差异有统计学意义（P<005）。见表4、表5。

242组PI3K/AKT信号通路标志性蛋白比较与治疗前比较，2组治疗后各时间PI3K、pAKT、bcl水平均下降（P<005），而bax水平则升高（P<005），各时间PI3K/AKT信号通路标志性蛋白变化对照组比观察组更明显，差异有统计学意义（P<005）。见图1及表6。

3讨论

乳腺癌在当今竞争日益剧烈、生活压力越来越大的社会中，发病率与日俱增，常是由容易受到忽视的乳腺小叶增生或者囊性纤维化逐步演变和发展而来，到发现乳腺癌的时候，已经是不可治疗之时，多数采取乳腺切除，这对女性患者，尤其是仍有生育要求的年轻女性患者而言，无疑是沉痛打击。因此，近年来，研究中致力于探索一种不良反应小但有一定抑制癌细胞作用的药物，以期为乳腺癌患者带来福音，人们发现中成药可以满足以要求。本研究探索的康艾注射液，其方剂包括：黄芪、人参、苦参素。虽然其成分只有3种，但这3种中药是通过生化仪器提取出来的药液，有研究发现，其药液提取物有一定抗癌作用，但对于其机制，目前仍不明确，总体功效为增强机体免疫功能，益气复脉[11]。现代药理研究表明，人参对补充人体的元气，恢复精力，大有裨益，生津止喝，补肾益脾，可对神经系统产生一定兴奋作用，从而抑制肿瘤发展[12]。黄芪和人参对自然杀伤（NK）细胞有一定刺激作用，此外，能够增强巨噬细胞的作用，强化其吞噬及杀伤作用，对骨髓的代谢有一定促进和激发，可间接刺激白细胞生成，提高免疫力和抗癌能力，若与化疗药同时使用，可以扬长避短，缓解化疗药降白细胞的不良反应，从而降低化疗药物的不良反应[13]。苦参具有碱性的作用，清肺热除肝火，对机体的免疫功能具有一定调节作用，从而抑制癌细胞。因此，康艾注射液对乳腺癌患者的免疫功能有一定的提高作用，同时有一定抑制癌细胞的抗癌作用。

PI3K/Akt信号转导通路是抵抗细胞凋亡的，它对其下游的凋亡蛋白产生一定作用，并对细胞周期调节蛋白有一定介导作用，激发其效应，对细胞的凋亡、抑制增殖、细胞的恶变和细胞泡泡膜的转变有一定介导作用，故该信号转导通路是目前研究恶性肿瘤的重点。本研究采取该通路研究乳腺癌，大有裨益[14]。T淋巴细胞及其亚群等相关指标的水平是反映人体自身免疫力的最好的血清学指标，T细胞是机体最大免疫细胞亚群之一，其对维持体内内环境的稳定作用显著[15]。NK细胞可抗肿瘤，对肿瘤细胞直接损伤，此外可诱导白细胞介素2（IL2）、白细胞介素（IL6）、白细胞介素（IL10）和肿瘤坏死因子TNFα的产生，进而增加T淋巴细胞活性，故本研究对白细胞介素、肿瘤坏死因子等炎性反应指标，以及免疫指标进行探讨，探索康艾注射液对乳腺癌患者的免疫相关疗效[16]。

本研究发现，其临床疗效显著，对癌痛有一定缓解作用，提高患者生命质量，探索其作用是通过提高患者机体的免疫因子而实现。此外，本研究还发现，采用康艾注射液治疗，或对PI3k/akt信号转导通路有一定作用，并通过改变通路的作用起到抗癌效果。

由于本研究研究时间较短，纳入例数也不够多，仍不具有很强说服力，希望未来能通过大鼠实验，验证康艾注射液在PI3k/akt通路上的抗癌机制，以期为临床提供帮助，进一步提高乳腺癌或者其他恶性肿瘤患者的生命质量和免疫力。

参考文献

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