猪非典型性瘟病毒与猪流行性腹泻病毒双重PCR方法的建立与应用

杨晓宇 徐雷 殷鑫欢 张继宗 徐志文 朱玲

摘要：为了快速准确地检测出猪非典型性瘟病毒（APPV）与猪流行性腹泻病毒（PEDV），根据GenBank中发布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列，分别选取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列，设计、合成了1对特异性引物。通过对体系进行优化，分别扩增出190 bp和500 bp的特异性片段。建立的双重Rrr-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪轮状病毒（RV）的检测均为阴性。对PEDV和APPV的最低检出量分别为1μl 2.65x103和1μl 3.56x104，对四川遂宁、眉山等地采集到的腹泻、肌肉震颤的病料进行检测，PEDV、AP-PV阳性病料检出率分别为41.18%和11.76%，经分别与特异性检测APPV和PEDV的单一RT-PCR法检测结果进行比较分析，符合率均为100%。与单一RT-PCR检测方法具有相同特异性和重复性，可用于临床检测。

关键词： 猪非典型性瘟病毒：猪流行性腹泻病毒：双重RT-PCR

中图分类号：S852.65+1

文献标识码：A

文章编号： 1000-4440（2018）05-1081-06

猪非典型性瘟（APP）是猪非典型性瘟病毒（A—typical porcine pestivirus virus，APPV）引起的仔猪先天性震颤（俗称“抖抖病”），APP在临床上可以导致出生仔猪全身肌肉震颤、八字腿、严重可导致全身震颤，吮乳困难。规模化养殖场猪发病率在5%左右。先天性震颤（Congenital tremor）可以分为A、B两种类型，B型没有明显的组织损伤，A型有明显的大脑脊柱的组织损伤。根据脑和脊柱的受伤程度可将A型分为I—V5种亚型，其中A-III型先天性震颤是只有在长白猪品种中存在的遗传性疾病，其特征是髓鞘缺失，少突细胞减少;A-IV型，其特点是脑脊髓髓鞘形成过少引起的;A-V型病例是由敌百虫中毒引起，常导致小脑发育不全;只有A-I与A-II是传染病，A-I型是由猪瘟病毒（CSFV）引起的，但是A—II型的病因此前尚未可知。Hause等验证了APPV是引起仔猪先天性震颤的主要病原，通过分子和血清学检测，证明了APPV在美国猪群的广泛存在，随后，德国、荷兰、奥地利等多个国家先后发现猪群存在APPV流行。猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）是引起猪流行性腹泻（Porcineepidemic diarrhea，PED）的主要病原，PED是临床上引起水样腹泻、严重肠炎、呕吐、脱水和食欲下降为症状的高度接触性肠道传染病。由于其传染性强和较短的病程，哺乳仔猪的死亡率可达50%～ 90%，给养猪业带来巨大的损失。1977年，在比利时养猪场分离出一种与腹泻相关的新型冠状病毒样颗粒，随后在中国、加拿大、德国、日本、韩国等国家相继报道了该病毒。2009年以来，韩国、日本相继有PED发生，2010年冬季以来，中国也大规模爆发PED。

APPV和PEDV都是RNA病毒，均可导致出生仔猪发病。母源抗体是保护仔猪预防PEDV的重要手段之一。APPV的感染导致仔猪吮乳困难，严重影响仔猪对母乳的摄入，从而导致母源抗体对出生仔猪的保护力不足。为了进一步研究APPV和PEDV两者之间的感染状况与疾病的损伤，本试验建立了同时检测APPV和PEDV的双重RT-PCR方法，为疾病诊断提供一个快速、灵敏、高效的检测方法，为疾病防控提供合理依据。

1 材料与方法

1.1 病毒和病料

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪非典型性瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒（Rotavirus，RV）、大肠杆菌（Escherichia coli）均由四川农业大学动物生物技术中心保存;病料（肠道、肠系膜淋巴结、脑、腹股沟淋巴结）采自四川眉山、遂宁、宜宾、泸州、自贡等各市规模化养猪场。

1.2 主要试剂

DL2000 DNA Marker、RNAiso plus、Taq Hs、10×Reaction Buffer（Mg2+ free）、dNTP Mix、ddH2 0、pMD19-T载体均购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA凝胶回收试剂盒（DNA Gel Extraction Kit）和質粒提取试剂盒（Plasmid Kit I）购自Omega公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中发表的PEDV S2基因（登录号：JQ638513.1）和APPV NS3基因（登录号：MF069133.1）相关序列，选取其保守序列，并通过NCBI进行特异性比对，分别设计了一对特异性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 样品处理及核酸的提取

将获得的PEDV和APPV样品分别编号，将编号的样品在研磨器中多点取样，剪碎后加入适量的液氮，研磨成粉末状后加生理盐水形成研磨液，-20℃反复冻融3次后备用。采用Trizol法提取病料的总RNA，随后用反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。转录体系（10μl）为：总RNA 3.0μl，5xPrimescript buffer2.0μl，Primer script RT en-zyme Mix1 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6mers 0.5μl，RNase free dH20 3.5μl。反转录的条件是：37℃15min，85℃30s，将转录产物置于-20℃保存备用。

以反转录得到的cDNA为模板，用所设计的引物对模板进行扩增。扩增体系为（25μl）：总RNA2.0μl，1OxReaction buffer 2.5μl，dNTP Mixl.0μl，Taq Hs 0.5μl，dd H20 18.0μl，上下游引物各0.5μl。反应条件为：95℃4 min;95℃30 s，58℃30s，72℃30s，30个循环：72℃7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 目的片段的克隆及测序

将扩增出来的单一条带用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，连接pMD19-T载体，转化到DH5a感受态细胞中。将阳性克隆送到生工生物工程（上海）有限公司测序，并将阳性菌扩大培养后用质粒提取试剂盒提取PEDV、APPV质粒，作为后续试验的阳性模板。

1.6 双重RT-PCR的建立

1.6.1 Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量的优化 在单一PCR的基础上，分别改变单一变量对PEDV和APPV的混合模板进行检测。体系为25μl，分别调整Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix的用量，选取Mg2+的用量依次为0.5μ1、l.0μl、1.5μ1、2.0μl、2.5μl和3.0μl，选取Taq Hs的用量依次为0.1μl、0.2μ1、0.3μ1、0.4μl、0.5μl和0.6μl，选取dNTP Mix的用量依次为1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl和3.5μl。进行双重RT-PCR扩增，反应程序同方法1.4单一PCR扩增。在保证单一变量的情况下，选取目的条带效果最好的试剂用量。

1.6.2 引物及退火温度的优化 在优化Mg2+、TaqHs、dNTP Mix用量的基础上，单一改变引物用量和退火温度，其引物用量选取1.0μl、1.5μl、2.0μl和2.5μ1，退火温度选取50.8℃、51.8℃、53.1℃、58.6℃、59.9℃、61.0℃和61.6℃。用来筛选最适引物用量和退火温度。

1.6.3 特异性试验在上述优化的基础上，用建立的双重RT-PCR方法对PRRSV、CSFV、RV、PEDV、APPV进行特异性检测，设立阴性对照，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6.4 重复性试验对APPV和PEDV阳性病料进行抽提，以反转录好的cDNA为模板，用建好的双重RT-PCR方法分别进行批间、批内重复性试验，已验证所建立方法的稳定性。

1.6.5 敏感性试验 用质粒提取试剂盒提取PEDV、APPV质粒，用核酸蛋白仪测定所构建的阳性质粒的质量浓度，计算出模板的拷贝数。在上述优化体系优化后，将模板倍比稀释进行双重RT-PCR。

1.6.6 符合性检测 用本研究建立的双重RT-PCR方法對四川遂宁、眉山等地采集的病料进行双重RT-PCR和单- PCR的检测，并对结果、检出率和符合率进行对比分析。

2 结果

2.1 Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量的优化

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，当Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix依次为2.5μ1、0.6μl、1.0μl时，扩增出来的2条条带最为清晰（图l、图2、图3）。

2.2 引物及退火温度的优化

优化结果显示为，当引物用量为lμl（图4），退火温度为58.6℃时（图5），该方法同时扩增出来的APPV和PEDV特异性条带亮度相对最清晰。

2.3 特异性试验

用所建立的双重RT-PCR对PRRSV、CSFV、RV、APPV、PEDV进行检测，结果（图6）显示，PRRSV、CSFV、RV均为阴性，该方法能特异性检测出APPV和PEDV，证明该方法具有很强的特异性。

2.4 重复性试验

用所建立的双重RT-PCR对阳性模板进行批间与批内重复性检测，结果（图7）显示阳性模板所扩增出来的目的条带完全相同，证明该方法有良好的重复性。

2.5 敏感性试验

采用建立的双重RT-PCR的方法和优化的体系对倍比稀释后的模板进行扩增，结果（图8）显示PEDV的最低检出量为lμl 2.65×l05，APPV的最低检出量为lμl 3.56x104，证明该方法敏感性较强。

2.6 符合性检测

对34份采自四川遂宁、眉山等地的疑似病料进行双重RT-PCR和单一PCR的检测，结果（表2）显示检出PEDV阳性病料14份，单一感染阳性率41.18%。检出APPV阳性病料4份，单一感染阳性率11.76%。检出二者混合感染l份，检出率2.94%。双重RT-PCR与单一PCR检测结果进行比较分析，符合率均为100%（表3）。

3 讨论

最近几年，PEDV的感染率越来越高，由于其传染性强和较短的病程，哺乳仔猪的死亡率可达50%～90%.给养猪业带来巨大的损失。新生仔猪的免疫系统发育不完全，对其进行PEDV疫苗注射无法诱导产生有效的体液免疫和肠道黏膜的免疫，所以母源抗体对新生仔猪尤为重要。初乳中免疫球蛋白主要为IgG，乳汁中主要为SIgA，乳汁的黏膜免疫对新生仔猪保护力已经被试验证明。新生仔猪需要足够的免疫乳汁来抵抗PEDV感染，所以新生仔猪能够喝到初乳和乳汁尤为重要。先天性震颤是新生仔猪常见的一种现象，会导致新生仔猪全身肌肉震颤，尽管摇动本身并不直接导致死亡，但震颤可以妨碍仔猪发现奶嘴，从而导致仔猪喝不到足够的初乳和乳汁，严重的可导致发育迟缓或死亡。自2010年，新一轮PEDV在全球流行，作者认为，造成PEDV新一轮流行的原因除了PEDV变异株的出现，规模化养殖场疫苗免疫程序不当，现行疫苗无法对其进行有效的保护之外，出生仔猪是否能够得到母源抗体的保护也是一个很重要的方面。而非典型性瘟病毒恰恰会导致出生仔猪全身震颤，妨碍仔猪发现奶嘴。有报道，中国新生仔猪先天性震颤在规模化猪场发病率约为5%～6% ，在大多数受到新生仔猪先天性震颤影响的猪场中，APPV的发现率在1%～20%。本次试验建立的双重RT-PCR方法，通过优化反应体系和试剂用量，可以同时检测出PEDV、APPV。相较于单一RT-PCR方法更为简单、省时、省力，同时也节约了检测试剂的损耗。根据PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列设计引物，保证了扩增出来的目的片段高度保守，防止了因为病毒的变异而导致试验结果的假阴性。研究中所设计的2对引物分别能够扩增出190 bp和500 bp的目的条带，与设计的引物长度一致，证明了该方法的特异性。对PEDV和APPV的最低检出量分别为lμl 2.65xl05和1μl 3.56x104，具有较高的灵敏性。对样品进行符合性检测，符合率为100%，证明该方法的可行性。相较于单一RT-PCR方法，省时、省力、特异、敏感，对PEDV和APPV混合感染的检测及流行病学调查具有重要意义。