4种叶菜对强力霉素的吸收与富集特征

张圣新 罗盼盼 鲍恩东 尚斌 王冉 魏瑞成

摘要：通过水培试验，对畜牧业中广泛使用的典型兽药强力霉素，开展了4种叶菜（绿罗莎、苦苣、绿箭和绿直立）的吸附富集特征及去除规律研究，评价抗生素环境污染的植物修复能力。结果表明：强力霉素在有蔬菜种植的培养液中降解速度明显快于无蔬菜种植的培养液，空白对照组中去除率37.8%，而在叶菜处理组中去除率超过95%，在空白对照培养液以及绿罗莎、苦苣、绿箭和绿直立的培养液中强力霉素去除半衰期分别为22.1d、1.4d、1.5d、2.3d和2.8d，与空白对照相比差异极显著（P<0.01）;在吸收富集能力上，绿罗莎和苦苣茎叶部分对强力霉素具有较强的累积作用，富集系数分别为7.20和4.95，而绿箭和绿直立的富集系数分别为0.76和0.49，累积作用相对较弱。说明富集能力较强的蔬菜作物可作为降低抗生素环境污染的备选植物。

关键词：强力霉素;富集：植物修复

中图分类号：X592

文献标识码： A

文章编号： 1000-4440（2018） 05-1066-06

在畜禽养殖业中，兽药抗生素在提高生产能力等方面发挥了重要作用，中国每年兽药使用量大概占全球消耗量的25%左右。据报道，动物采食饲用抗生素后，约有30%～ 90%兽药以母体或代谢物的形式经动物粪尿等排泄物排出。目前，中国尚未制定动物粪便和土壤中抗生素相关污染标准.粪肥的施用引起抗生素在环境介质及食物链中迁移累积。研究发现，规模化养殖场畜禽粪污中和农产品产地土壤中可检测到四环素类、磺胺类、喹诺酮类等多种抗生素药物。环境中抗生素对作物生长具有毒性效应，会诱导处于长期选择压下的病原菌产生抗性，长期摄入受到污染的产品可能对易感人群产生不良反应。

强力霉素（Doxycycline，DOX）为四环素类抗生素，在养殖场广泛使用，四环素类抗生素对土壤有较强的吸附力，在环境中不易降解等。通过超富集作物品种吸收进行植物修复，或者通过充分利用低积累作物品种的种植来减少土壤污染从而生产安全食品，利用超富集作物品种修复污染土壤是当前较为经济有效的环境中抗生素污染的修复手段。在富集植物的筛选中，水培试验是理想的手段，虽然液体中植物根部对抗生素的吸收量相对于土壤环境下较高，但是水培方法周期短和环境条件可操控，能充分排除干扰因素并快速筛选出富集植物。

本试验以强力霉素为研究对象，考察4种叶菜品种在水培条件下对强力霉素的富集特征，比较不同植物对强力霉素的吸收量和富集系数的变化，研究强力霉素在培养溶液中的去除规律，为科学认识蔬菜中抗生素残留风险以及抗生素污染土壤的植物修复技术应用提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选择绿罗莎、苦苣、绿直立和绿箭4种蔬菜品种为试验对象。强力霉素标准品（纯度≥97.0%）购自Dr.Ehrenstorfer公司，甲醇和乙腈（色谱纯）购自Te-dia公司，乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠、乙二酸、硝酸钙、硝酸钾、乙二胺四乙酸二钠铁、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、硫酸镁、硼酸、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰和钼酸铵均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器设备

三重四极杆质谱仪（Agilent 6410，配ESI源）、高效液相色谱仪（Agilent1200S）为Agilent公司产品，分析天平（AL204）和pH计（320）为梅特勒一托利多仪器有限公司产品，高速离心机（Eppendorf）为德国Eppendorf公司产品，氮吹仪（N-EVAPTM112）为美国Organomation公司产品，固相萃取装置为美国Supelco公司产品，HLB固相萃取柱（200mg，6ml）为美国Waters公司。

1.3 营养液配制和预培養

水培营养液由营养液A和营养液B组成，使用前按照等比例混合。营养液A成分为：硝酸钙413.300mg/L、硝酸钾404.400mg/L和乙二胺四乙酸二钠铁40.000 mg/L;营养液B成分为：磷酸二氢钾68.000mg/L、磷酸二氢铵32.000mg/L、硫酸镁246.000 mg/L、硼酸2.000mg/L、硫酸锌0.430mg/L、硫酸铜1.360mg/L、硫酸锰0.100mg/L和钼酸铵0.034 mg/L。

在蔬菜收割前20 d，将移栽的蔬菜苗定植于黑色塑料试验盆内，每盆4株。试验设置5个处理组，第1组为含有20 mg/L强力霉素的空白对照组，第2至第5组分别为种植绿罗莎、苦苣、绿直立和绿箭的处理组。加入营养液后在温室中预培养3d，日光灯补充光照，光暗比为12 h∶12 h，昼夜温差10℃。培养过程中补充营养液并记录用量。

1.4样品采集和强力霉素含量测定

试验时向每个试验盆内加入一定浓度和体积的强力霉素储备溶液，使培养液中强力霉素质量浓度为20mg/L。分别在试验的第Od、ld、2d、3d、4d、Sd、7d、9d、11d、13d、15d对不同试验组植株和培养液取样，将去除根部的植株用蒸馏水冲洗，晾干后用粉碎待测。

准确称取样品5.0g至50ml离心管中，加入20ml甲醇和0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（pH=6.0），漩涡30 s，振荡10 min，超声波处理20min，10000 r/min离心5min，移取上清液至另一离心管中，重复提取2次，合并上清液，于40℃下氮气吹至5—10 ml，加0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（pH=6.0）稀释至30—50 ml，备用。将HLB固相萃取柱依次用6ml甲醇、6ml 0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（pH=4.0）活化，将上述提取液过柱，流速≤3 ml/min，用10 ml水淋洗，抽干。8ml甲醇洗脱，收集洗脱液，于40 ℃下氮气吹干，加人流动相1.0 ml溶解残余物，超声波处理2min，混匀后过0.22μm尼龙滤膜，待仪器测定。

测定参数：C18柱色谱柱（2.1mmX100.0mm），流速为0.30ml/min.流动相为甲醇和0.1%甲酸溶液（体积比60∶40）;电喷雾离子源正离子模式，喷雾电压为4.0 kV，气体温度为350℃，气体流速为12L/min.强力霉素的特征离子对为m/z 445>428（定量离子），m/z 445>410以及m/z 445 >154。测定时为了减少基质效应干扰，植株样品的标准曲线用无抗生素处理的植株提取溶液配制，培养液样品的标准曲线用营养液作为背景溶液配制。强力霉素在叶菜样品中平均回收率72.16%～ 88.64%，日内相对标准偏差为3.51%～6.87%，日间相对标准偏差为1.44%～1.82%，方法满足试验研究要求。

1.5 数据分析

数据应用SPSS 16.0软件进行Duncan's差异性统计分析。富集系数计算（Bioconcentration fac-tor，BCF）公式为BCF=C植株/C培养液，式中，C植株和C培养液分别为植株中强力霉素含量和培养液中强力霉素质量浓度。

2 结果与分析

2.1 水培叶菜对强力霉素的吸收转移

4种供试叶菜对强力霉素具有相似的吸收与转移规律（图1）。在处理后7d，4种蔬菜的茎和叶中强力霉素含量快速上升，在第5～7d达到最大吸收值，随后随着暴露时间延长含量急剧下降。绿罗莎茎和叶中强力霉素含量在处理后5d达到最大值（20.60 mg/kg）。在处理后24h，强力霉素在绿罗莎茎、叶中的含量为2.59 mg/kg，在处理结束时（15d），绿罗莎茎、叶中的含量为6. 18 mg/kg，分别是其最大吸收量的12.6%和30.0%。苦苣、绿直立和绿箭茎、叶中强力霉素含量均在处理后7d达到最大值，分别为10.40mg/kg、1.79mg/kg和3.54mg/kg。在处理后24h，苦苣、绿直立和绿箭茎、叶中强力霉素的含量分别为1.83mg/kg、0.60mg/kg和0.31mg/kg，分别是最大吸收量的17.6%、33.6%和8.9%。处理后15 d，苦苣、绿直立和绿箭茎、叶中强力霉素的含量分别为4.07mg/kg、0.39mg/kg和0.81mg/kg，分別是其最大吸收量的39.1%、21.7%和23.0%。

尽管4种供试叶菜对强力霉素的吸收和转移具有相似的规律，但在达到对强力霉素最大吸收值所需要的时间和最大吸收量等方面仍然存在差别。通过比较发现，强力霉素在绿罗莎茎、叶中的含量是其在苦苣、绿箭和绿直立茎、叶中含量的2倍、6倍和11倍，强力霉素在苦苣茎、叶中的含量是其在绿箭和绿直立茎、叶中含量的3倍和6倍。说明4种叶菜对强力霉素的吸收能力具有很大差异，在同一处理质量浓度下，绿罗莎富集能力最大，其次是苦苣，它们与其他2种蔬菜相比较差异均极显著（P<0.01），绿箭和绿直立之间富集能力差异不显著，4种叶菜对强力霉素的吸收富集能力高低顺序为：绿罗莎>苦苣>绿箭>绿直立。

2.2 不同处理时间下4种叶菜培养液中强力霉素质量浓度的变化

在不同处理时间下培养液中强力霉素质量浓度变化如图2所示。强力霉素在4种叶菜培养液中具有相似的去除规律，在空白对照组（无蔬菜植株）的培养液中去除最慢，在绿直立和绿箭的培养液中的去除速度比对照组快，在绿罗莎和苦苣培养液中去除速度最快。处理后ld，绿罗莎和苦苣的培养液中强力霉素去除率为53%—59%，绿箭和绿直立的培养液中强力霉素去除率为48%左右，与初始浓度相比差异均显著（P<0.01），而空白对照组去除率仅为2.3%，与初始浓度相比差异不显著，说明绿罗莎、苦苣、绿直立和绿箭植株对强力霉素均有较强的吸收和富集能力。

在处理15d后，强力霉素在空白对照培养液中去除了37.8%，在4种叶菜培养液中去除率超过95.0%，与对照组比较差异极显著（P<0.01）。强力霉素在空白对照、绿罗莎、苦苣、绿箭和绿直立的培养液中的去除半衰期分别为22.1d、1.4d、1.5d、2.3d和2.8d（表1）。

2.3 水培叶菜对强力霉素的富集系数

绿罗莎、苦苣、绿箭和绿直立4种叶菜茎和叶对强力霉素的富集系数分别为7.20、4.95、0.76、0.49。富集能力大小依次为绿罗莎>苦苣>绿箭>绿直立。绿罗莎和苦苣对强力霉素的富集系数均大于l，说明这2种叶菜对强力霉素的吸收富集能力较强，属于超富集作物，而绿箭和绿直立对强力霉素的富集系数均小于1。说明对强力霉素的吸收和累积大小与植物种类有关，这与已经报道的四环类抗生素在植物中吸收特征相一致。

3 讨论

本研究结果表明，在短时间内4种叶菜对强力霉素具有相似的吸收和转移的规律，但是由于植物对抗生素等有机污染物的吸收转移能力，与植物和有机污染物的特性以及环境污染强度等因素有显著相关性，所以4种蔬菜的富集能力表现出明显差异，在同一处理质量浓度下，吸收富集能力高低顺序为：绿罗莎>苦苣>绿箭>绿直立。许多文献也报道，不同种类的水生植物对介质中抗生素的吸收效率存在差异。崔馨等采用水培法研究了生菜对土霉素的吸收效果，发现生菜对土霉素的吸收量与营养液中土霉素质量浓度呈正相关。Lu等研究发现凤眼莲根系与水体接触12 h后，对水体中四环素的吸收率可达70%。Hijosavalsero等研究了人工湿地污水处理系统对强力霉素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑等抗生素的吸收效果，同样发现不同种类的植物对抗生素吸收存在明显差异。由此可见，通过种植合适的植物可以进行污染土壤的植物修复。

处理15d后，在4种叶菜培养液中强力霉素去除率超过95.0%，而在空白对照培养液中去除率仅37.8%，可见培养液中强力霉素含量减少主要是受到植物吸收的影响。Azanu等发现胡萝卜和生菜能够吸收四环素和阿莫西林，并遵循剂量效应关系。Mwm用土霉素和泰乐菌素的发酵垃圾作为番茄肥料时发现其可以吸收残留的抗生素。Dong等报道11种蔬菜在2种不同土壤中对金霉素、莫能菌素、磺胺二甲嘧啶、泰乐菌素和维及霉素存在不同程度的吸收。这些结论均与本研究一致，说明强力霉素含量的减少可能与蔬菜的生长稀释和植物体内代谢及组织形成无法提取的结合残留物相关。研究发现植物对环境中污染物的吸收机制主要有2种，分别是植物的外排机制（即将大部分污染物累积在根部）和植物的积累（将根系吸收的污染物多数运输和贮存到地上部分）。通过强力霉素在4种叶菜培养液中的去除试验发现，处理第ld4种蔬菜对强力霉素的去除率为48%—59%，并被植物根吸附后向茎叶转移，在试验的5～7d，绿罗莎和苦苣茎、叶中强力霉素含量是绿箭和绿直立中的3—11倍。据报道，1.0

本试验发现，叶菜绿罗莎和苦苣对培养液中强力霉素均有很强的吸收富集作用，富集系数分别为7.20和4.95，属于超富集作物，而绿箭和绿直立对培养液中强力霉素的吸收富集能力较弱，富集系数分别为0.76和0.49，属于低积累蔬菜作物。这些不同蔬菜之间富集系数的差异证明植物对抗生素的吸收可能取决于植物的种类，而同一株植物不同时间的吸收差异可能是由于植物不同生长阶段会影响抗生素在其体内的分布和积累。除此之外，抗生素的物理化学性质和环境暴露都可能影响植物对抗生素的富集。因此可以利用超富集植物（例如绿罗莎和苦苣）进行污染土壤的植物修复，或者种植低积累作物品种（例如绿箭和绿直立）以保证食品安全，以及利用抗生素低积累作物品种和超富集植物间套种植对污染土壤进行修复并生产出较为安全的农产品，以实现经济效益和生态功能的有机结合。