盐胁迫下棉花萌发、成苗和产量相关性状的QTL定位

徐剑文 孔杰 赵君 王为然 刘剑光 朱家辉 王希睿 徐海江 肖松华 阿里甫·艾尔西

摘要：利用感盐棉花品种泗抗1号和耐盐棉花新品系苏S012为亲本配置杂交组合，构建F，分离群体和F2∶3。家系。分别调查2个亲本和299个F2∶3家系萌发期、苗期以及铃质量、铃数、衣分和产量的盐害率，作为QTL定位的表型数据。在棉花A5、D5、D8、Dl0、A13和D13染色体上共定位到13个耐盐相关QTL，分别解释2.81%、15.18%、1.78%、5.39%、2.92%、8.38%、9.65%、5.06%、0.46%、2.17%、2.27%、13. 25%、1.50%的表型变异率。

关键词：棉花;耐盐性;分子标记;QTL定位

中图分类号：S562.035.3

文献标识码：A

文章编号： 1000-4440（2018） 05-0972-06

提高作物产量和开发新的耕地，是提高农业生产效率的2个重要方式。而盐胁迫作为一种主要的环境胁迫，是提高土地利用率的重要限制性因素。中国西北、东北及滨海地区的盐碱荒地和盐碱障碍耕地总面积超过3.33xl07 hm2.其中具有农业利用潜力的近1.33xl07hm2.占全国耕地总面积的10%以上。棉花作为耐盐先锋作物，在盐碱地广泛种植，在提高土地利用率上发挥了重要作用。通过现代分子生物学方法进一步提高棉花的抗盐性，对于发掘盐碱地利用潜力具有极其重要的意义。

盐胁迫影响棉花从出苗到成熟各阶段，其危害程度最终以产量和纤维品质表现。萌发期，盐胁迫主要影响种子的吸胀吸水，延缓棉花萌发，并降低萌发率。苗期，盐胁迫会引起幼苗畸形，阻碍叶绿素合成，尤其是二、三叶期的幼苗对盐胁迫最为敏感，严重时棉花叶片发软、色暗、功能期短，侧根发生少，干物质积累减少，生长缓慢，甚至死苗。现蕾期，盐胁迫会导致棉花生长势下降，果枝数目减少，进人生殖生长期延迟。开花期，受盐胁迫影响，棉花花期缩短，结铃性降低，并且棉铃发育受到抑制，铃质量下降。棉花不同品种之间和同一品种不同生长阶段之间的耐盐性都有明显的差异。从棉花生育期看，幼苗阶段和开花结铃期对盐胁迫较为敏感，特别是三叶期前的幼苗。通过传统育种方式提高棉花耐盐性的效率低，周期长，投入高。转基因育种和分子标记辅助育种技术是提高育种进程的有效策略。其中，耐盐碱基因的发掘是转基因育种的重要基础之一。而开发与耐盐性状连锁的分子标记，是分子标记辅助育种的重要组成环节。

本研究利用感盐棉花品种泗抗l号和耐盐棉花新品系苏S012为亲本配置杂交组合，构建F，分离群体和F2∶3家系，分别调查2个亲本和F2∶3家系的萌发期、苗期以及铃质量、铃数、衣分和产量的盐害率，作为QTL定位的表型数据，用2500对SSR引物筛选在两个亲本间具有多态性的标记，构建棉花遗传连锁图谱，筛选与耐盐基因紧密连锁的分子标记，对棉花耐盐性状QTL进行定位，为进一步定位克隆棉花耐盐基因奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2015年夏季在江苏省南京市以耐盐棉花新品系苏S012为母本、感盐棉花品种泗抗l号为父本杂交获得F1代种子。2015年冬季在海南省三亚市种植F1代，自交获得F2代种子。2016年夏季在南京种植含有299个单株的F2代分离群体，人工自交获得F2∶3家系。2017年夏季在江苏省大丰市沿海滩涂盐碱地种植亲本、F1和F2∶3家系。

1.2耐盐性状调查

2017年夏季在大丰市稻麦原种场盐碱地直播种植两亲本和F2∶3家系，设3次重复，土壤含盐量为0.458%，在相邻非盐碱地直播两亲本和F2∶3家系作为对照。播种后10 d统计出苗率，三叶期统计幼苗存活率。吐絮后，调查单株铃数，计算亲本和每F2∶3家系的平均单株铃数。收取50铃，调查单铃质量和衣分。收取亲本和每家系全部籽棉，计算产量。计算相对盐害率，萌发相对盐害率=（对照出苗率一盐碱地出苗率）/对照出苗率×100%，苗期相对盐害率=（对照存活率一盐碱地存活率）/对照幼苗存活率×100%，铃质量相对盐害率=（对照铃质量一盐碱地铃质量）/对照铃质量x100%，铃数相对盐害率=（对照铃数一盐碱地铃数）/对照铃数×100%，衣分相对盐害率=（对照衣分一盐碱地衣分）/对照衣分×100%，产量相对盐害率=（对照产量一盐碱地产量）/对照产量×100%。

1.3 F2∶3家系耐盐性状的相关性分析

利用SPSS 22软件，对F2∶3家系的萌发相对盐害率、苗期相对盐害率、铃质量相对盐害率、铃数相对盐害率、衣分相对盐害率和产量相对盐害率进行双变量相关性分析，相关系数选用Spearman，显著性检验选用双尾检验，并对显著性相关进行标注。

1.4 棉花基因组DNA提取、亲本多态性引物筛选

用CTAB法提取苏S012、泗抗l号和299个F2代单株的基因组DNA。在Cottongen数据库（ht-tps：//www.cottongen.org/search/markers）中选择2500对SSR（Simple sequence repeat）引物，由南京金斯瑞公司合成，检测2个亲本基因组之间的多态性，并用多态性引物对F2单株进行PCR扩增检测。参照张军等的方法进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染。

1.5 遗传连锁图谱的构建

利用JoinMap3.0软件对多态性引物进行分析，并参考分子标记的染色体定位信息，构建遗传连锁图谱。利用Windows QTLs Cartographer 2.0軟件的复合区间作图法检测棉花耐盐碱性状的QTL，进行1 000次随机抽样测验，选择LOD值≥2.5的QTL，并计算贡献率（R2）、加性效应（A）和显性效应（D）。利用MapChart 2.1软件绘制遗传图谱。

2 结果与分析

2.1 亲本苏S012和泗抗1号的耐盐性

萌发后10 d、幼苗三叶期分别调查亲本材料苏S012和泗抗1号在盐碱地和非盐碱地的萌发率、成苗率，并在吐絮后调查亲本材料的衣分、单铃质量、单株铃数和产量（表1）。结果显示，受盐胁迫影响，苏S012和泗抗l号的萌发率、成苗率、衣分、单铃质量、单株铃数和产量都显著降低。进一步计算相对盐害率后发现，苏S012的萌发相对盐害率、苗期相对盐害率、衣分相对盐害率、铃质量相对盐害率和产量盐害率均显著低于泗抗l号，而泗抗l号的铃数相对盐害率显著低于苏S012，并且两亲本材料在萌发相对盐害率、苗期相对盐害率、衣分相对盐害率、铃数相对盐害率上的差异达到了极显著水平。说明亲本材料苏S012在萌发期、苗期以及衣分、单铃重和产量上耐盐性显著高于泗抗l号，而在单株铃数上，泗抗l号的耐盐性显著高于苏S012。

2.2 F2∶3家系耐盐性状相关性分析

利用SPSS 22软件对F2∶3家系的萌发相对盐害率、苗期相对盐害率、衣分相对盐害率、铃质量相对盐害率、铃数相对盐害率和产量相对盐害率之间的相关性进行分析。结果（表2）显示：萌发相对盐害率与苗期相对盐害率、衣分相对盐害率、产量相对盐害率呈正相关关系，与铃数相对盐害率呈负相关关系;苗期相对盐害率与产量相对盐害率呈正相关关系，与铃数相对盐害率呈负相关关系;衣分相对盐害率与铃质量相对盐害率呈正相关关系：铃质量相对盐害率与产量相对盐害率呈正相关关系：铃数相对盐害率与产量相对盐害率呈负相关关系。

2.3 棉花连锁图谱构建

用2 500对SSR引物，检测两亲本之间的多态性，共筛选到68个多态性位点，多态性频率为2.72%。用68个多态性SSR引物检测299个F2∶3家系的基因型，并用Jionmap软件构建连锁图（LOD≥3）。所绘制连锁图包含20个标记和8个连锁群，长度在15.0cM至68.3 cM之间，总长度为259.4 cM.标记间平均距离为21.74 cM，各连锁群含2至4个标记。根据棉花分子标记数据库（https：//www.cottongen.org/search/markers）数据，这8个连锁群被定位在棉花A5、D5、D8、Dl0、A13和D13染色体上，其中D5和Dl0染色体上定位到了2个连锁群（图1）。

2.4 棉花耐盐QTL初定位

分别用F2∶3家系的萌发相对盐害率、苗期相对盐害率、衣分相对盐害率、铃质量相对盐害率、铃数相对盐害率和产量相对盐害率，在Windows QTLs Cartogra-pher 2.0软件中用复合区间作图法检测耐盐相关QTL，共检测到13个LOD值大于2.5的QTL位点（图l、表3）。其中用萌发相对盐害率数据共检测到1个QTL，命名为qSTG，位于Dl0染色体上，表型贡献率为2.81%。用苗期相对盐害率数据共检测到4个QTL，命名为qSTS-/、qSTS-2、qSTS-3、qSTS-4，分别位于A5、D5、Dl0、D13染色体上，表型贡献率分别为15.18%、1.78%、5.39%、2.92%。用衣分相对盐害率数据共检测到2个QTL，命名为qSTL-1、qSTL-2，分别位于D5和A13染色体上，表型贡献率分别为8.38%和9.65%。用铃质量相对盐害率数据检测到1个QTL，命名为qSTW，位于D8染色体上，表型贡献率为5.06%。用铃数相对盐害率数据共检测到3个QTL，命名为qSTBN-1、qSTBN-2、qSTBN-3，分别位于D5、Dl0和D13染色体上，表型贡献率分别为0.46%、2.17%、2.27%。用产量相对盐害率共检测到2个QTL，命名为qSTP-1、qSTP-2，分别位于A5、Dl0染色体上，表型贡献率分别为13.25%、1.50%。

3 讨论

盐胁迫首先对植物造成持续存在的渗透胁迫，并表现为离子失调引起的毒害和营养亏缺，继而引起氧化胁迫并导致膜透性改变、代谢紊乱、有毒物质积累，最终影响植物的生长发育和形态建成。植物耐盐碱性是一个复杂的生物机制，是各种生理生化过程协同作用的结果。在进化过程中，植物形成避盐和提高耐盐性2种机制以应对盐胁迫带来的危害。避盐主要包括泌盐、稀盐、积盐和拒盐4种方式。植物主要通过渗透调节、营养元素平衡和增强抗氧化胁迫，提高耐盐性。大量相关基因在植物耐盐机制中起到重要作用，它们主要包括离子转运蛋白基因、渗透调节相关基因、信号传导相关基因、细胞抗氧化相关基因等。对这些基因的挖掘，有助于进一步提高植物耐盐性。

盐胁迫对棉花从出苗到成熟各时期都有不同的影响，尤其是幼苗期和开花结铃期更加敏感，盐胁迫的危害最终表现在产量和纤维品质上。此外，在直播条件下，盐碱地种植棉花的产量受萌发率、成苗率、单株铃数、单铃质量、衣分等多种性状共同决定。因此，只以棉花苗期萌发率作为耐盐指标进行QTL定位不能完全发掘耐盐相关基因。本研究在调查产量性状的同时，分别调查了萌发率、成苗率、铃质量、铃数和衣分5个表型数据，用于QTL定位，为较全面地发掘耐盐相关基因打下了基础。相关性分析结果表明，萌发率、成苗率、产量之间存在显著正相关，而铃质量和衣分之间也存在显著正相关。说明应对盐胁迫对产量的危害，可以通过发掘幼苗期耐盐相关基因：而应对盐胁迫对纤维品质的危害，仅仅发掘幼苗期耐盐相关基因则显得不足。QTL定位结果也显示，苗期耐盐相关QTL qSTS-/、qSTS-3分别与产量相关QTL qSTP一I、qSTP一2定位区间重合。同样说明通过发掘棉花苗期耐盐相关基因，可以应对盐胁迫对最终产量的危害。

盐胁迫下单铃质量是影响棉花产量的重要性状，本研究相关性分析结果表明铃质量相对盐害率与产量相对盐害率呈正相关关系。李建亮也发现，随着土壤盐浓度提高，苗期感盐品种中棉所102和耐盐品种中棉所103的產量都逐渐减少，并且两品种间的产量差异随盐浓度提高而增加，这种差异主要是由于盐分的提高显著降低了单铃质量和铃数。此外，本研究中F2∶3群体的铃质量相对盐害率与苗期相对盐害率之间的相关性不显著。在李建亮的研究中，苗期感盐品种中棉所102铃质量性状的耐盐性高于耐盐品种中棉所103，两品种在苗期的耐盐性和铃质量的耐盐性上没有直接相关性。因此，提高盐胁迫下棉花的铃质量，是增加盐碱地种植棉花产量的有效途径。根据F2∶3群体的铃质量性状，本研究在棉花D8染色体上定位到1个与盐胁迫下铃质量相关的QTL qSTBW，该QTL位点与萌发、成苗相关QTL位点的区间没有重合。对该QTL的进一步研究和利用将在棉花耐盐分子育种中发挥积极的作用。

单株铃数是影响棉花产量的另一个重要性状。QTL定位结果显示，铃数相关QTL qSTBN-1、qSTBN-2、qSTBN-3分别与qSTS-2、qSTG、qSTS-4的定位区间重合，而萌发相对盐害率、苗期相对盐害率与铃数相对盐害率呈显著负相关关系。推测原因是因为萌发期和苗期的耐盐性影响了成苗率，继而影响了种植密度，从而导致部分耐盐性较差的株系反而具有更多的铃数。本试验从实际生产角度出发，采用盐碱地直播的方式鉴定群体的耐盐性。若要揭示影响盐碱地结铃性的具体分子机制，需要再采用营养钵育苗后移栽的方式进行鉴定，才能获得影响盐碱地结铃性的更加精确的数据。

棉花基因组总长约为5000 cM.需要约5000个分子标记才能达到遗传图谱的表达饱和。本研究所用两个亲本材料均为陆地棉，遗传背景差异小，多态性SSR标记数量偏少，共筛选到68个多态性位点，多态性频率为2.72%。因此在遗传图谱中，标记间遗传距离较大，且标记数目较少。在下一步工作中，将通过开发新的分子标记，以及利用极端性状混池重测序（Bulk segregant analysis-sequence，BSA-seq）技术进一步缩小定位区间、加大遗传图谱饱和度。本研究的结果为未来耐盐相关基因的定位和标记辅助选择育种工作奠定了理论和实验基础。