蛴螬不同途径给药对干性年龄相关性黄斑变性模型Caspase—3、FasL、TNF—α、NF—κB表达的影响

谭涵宇　李建超

〔摘要〕 目的 研究蛴螬提取物口服和滴眼两种途径对年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）模型干预机制。方法 采用光损伤方法建立干性AMD活体模型，分别予以蛴螬提取物口服和滴眼，用药4周后，观察其对各细胞层半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspastic acid-specific protease 3，Caspase-3）、核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、跨膜蛋白（Fas ligand，FasL）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达的影响。结果 与空白组比较，模型组视网膜组织中的Caspase-3表达明显下降，FasL、TNF-α、NF-κB表达均增强（P<0.05），口服组和滴眼组组织中各项指标差异均无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，口服组和滴眼组中Caspase-3表达明显升高，FasL、TNF-α、NF-κB表达明显降低；与口服组比较，滴眼组所有指标差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 蛴螬提取物对感光细胞等細胞凋亡具有调节作用，表现为早期抑制，晚期促进。其调节作用可能是通过抑制或促进细胞凋亡关键因子Caspase-3表达实现的，同时通过抑制炎症相关因子FasL、TNF-α、NF-κB表达对慢性炎症具有抑制作用。

〔关键词〕 蛴螬提取物；给药途径；年龄相关性黄斑变性；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；肿瘤坏死因子α；跨膜蛋白；核转录因子κB

〔中图分类号〕R285.5；R774.1 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.003

Effect of Different Drug Administration Approaches of Grub on the Expression of Caspase-3，

FasL， TNF-α and NF-κB of Age-Related Macular Degeneration Models

TAN Hanyu1， LI Jianchao1，2*， PENG Jun1， WEN Xiaojuan1， ZHOU Yasha1， PENG Qinghua1*

（1. Key Discipline of Ophthalmology of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China；

2. Department of Ophthalmology， Shaanxi Hospital of TCM， Xi'an， Shaanxi 7100001， China）

〔Abstract〕 Objective To study the interventional mechanism of oral administration and eye drops of the grub extract on the age-related macular degeneration （AMD） model. Methods A Dry AMD living model was established by light damage method. Models were given grubs extract oral administration and eye drops respectively. After 4 weeks， the expression of cysreine aspastic acid-specific protease 3 （Caspase-3）， nuclear factor-κB （NF-κB）， Fas ligand （FasL）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） was observed. Results Compared with the blank group， the expression of Caspase-3 in the retina tissue of model group decreased significantly， and the expression of FasL， TNF-α and NF- κB increased （P<0.05）. Compared with the blank group， all indexes of the oral and eye drops groups had no significant difference （P>0.05）. Compared with the model group， the expression of Caspase-3 increased significantly in the oral group and the eye drops group， and the expression of FasL， TNF-α and NF-κB decreased significantly. Compared with the oral group， there was no significant difference in all indicators in the eye drops group （P>0.05）. Conclusion Grub extract has regulating action on photoreceptor cells apoptosis， such as performance for early suppression and lately acceleration. Its regulating effect is probably achieved by inhibiting or promoting the expression of Caspase-3. Grub extract shows inhibiting effect on chronic inflammation by inhibiting the expression of related inflammation factors， such as FasL， TNF-α， NF-κB.

〔Keywords〕 grub extract； administration route； age-related macular degeneration； cysreine aspastic acid-specific protease-3； tumor necrosis factor-α； fas ligand； nuclear factor-κB

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD），是一种与年龄有关的黄斑区视网膜组织退行性病变，本课题组前期研究证实：蛴螬提取物对大鼠视网膜的光损伤具有保护作用，可以促进HSP79的高表达，使视网膜视神经细胞得到有效保护，可减轻组织损伤[1-2]；能增强视网膜组织中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的表达、抑制神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表达，促进光凝后的视网膜修复[3]；能促进实验性有色兔脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）中血管生成素1（angiopoietin-1，Angl）的高表达，减少色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived Factor，PEDF）的表达，也可以抑制有色家兔CNV中的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和bFGF，从而抑制CNV的形成[4-5]。蛴螬可通过活化 NF-κB信号通路，有效地减轻光损伤诱发的光感受器细胞的凋亡，从而发挥防护作用[6]。蛴螬还能够改善视网膜局部微循环，减轻缺血缺氧对血管内皮细胞的损害[7]。本实验拟通过对蛴螬提取物口服、滴眼两种给药途径干预治疗干性AMD模型大鼠眼。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年SD大鼠40只，SPF级，体质量180～220 g，实验前排除全身性及眼部疾患，动物由湖南斯莱克景达动物实验有限公司提供，许可证号：SYXK（湘）2013-0004，在湖南中医药大学实验动物中心清洁级条件下饲养。

1.2 主要药品及试剂

蛴螬提取物：由湖南中医药大学药学院提供，分别按药物制剂工艺制成口服、滴眼剂[8]。

NF-κB一抗兔源性抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：Bs-0465R），TNF-α一抗兔源性抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA0131），FasL一抗兔源性抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA0049），Caspase-3一抗兔源性抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA2142），SP-9000通用型免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：WP132713）DAB浓缩型显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K142415E）。

1.3 主要仪器

裂隙灯显微镜（日本托普康公司），YD-A型生物组织摊片机（上海金迪生物技术工程有限公司），Motic BA410研究型显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），Motic 6.0数码医学图像分析系统（麦克奥迪实业集团有限公司），Leica石蜡切片机（德国Leica公司），H7700透射电子显微镜（日本日立公司），Eppendoff centifuge 58108高速冷冻离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）。

1.4 分组及干预

选用8周龄SD大鼠40只随机分成A、B、C、D 4组，分别为：空白组（A组）、模型组（B组）、口服组（C组）、滴眼组（D组）。C组予以蛴螬提取物口服剂灌胃，1次/d，5.6 g/（kg·d），D组予以蛴螬提取物局部滴眼，4次/d，A、B、D组每日以生理盐水2 mL灌胃，A、B、C各组同时予以玻璃酸钠滴眼液滴眼，4次/d，1滴/次。在造模起分别开始给药，连续4周。

1.5 视网膜光损伤模型的建立

采用自制光化学损伤装置[6]：在光照架的6个面分别放置1根40 W的白色荧光灯管。调节光照强度，并用ZDS-10型数字式照度计测定大鼠活动水平多点照度，平均为（2 000±200）1x。动物房的室温控制在21～24 ℃，光照箱内的平均温度为22～25 ℃。所有实验动物在12 h明（30～50 1x）及12 h暗环境下循环光环境适应7 d，自由摄食水。7 d后光照前先暗适应24 h，然后光照12 h（晚上8：00-次日早上8：00），再进行暗适应12 h，连续3个循环，光照时间总计为36 h。大鼠不散瞳，可在光照箱内自由活动，光照后送回暗环境中饲养。空白组不施行光照试验。

1.6 取材及指标检测

給药结束后，2%戊巴比妥钠过量（>0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠，摘除眼球，眼球标记定位。各组眼球经多聚甲醛固定，免疫组化检测（参照试剂盒说明书操作步骤）核转录因子κB（NF-κB）、膜表面分子（FasL）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）；采用Motic 6.0数码医学图像分析系统定量测量， 视网膜各组织细胞层Caspase-3、FasL、TNF-α、NF-κB等指标的阳性积分光密度。

1.7 统计方法

所有实验数据以“x±s”表示，用SPSS 19.0进行统计学处理。各组间光密度值采用单因素方差分析ANOVA，并进行方差齐性检验，组间两两比较用采用LSD（L）检验，Dunnett（E）双侧控制。P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 蛴螬提取物对视网膜组织Caspase-3表达的影响

空白组视网膜内界膜及内核层细胞浆细胞核中Caspase-3阳性物质表达较少，呈棕黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。模型组视网膜内界膜、内核层、外核层细胞浆细胞核中Caspase-3阳性物质表达明显，呈棕褐色，视网膜各层组织细胞结构出现紊乱。口服组和滴眼组视网膜内界膜、内核层细胞核及细胞浆中Caspase-3阳性物质表达程度明显较模型组减少，呈棕黄色，滴眼组减少更为明显，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。见图1。

2.2 蛴螬提取物对视网膜组织FasL表达的影响

空白组视网膜各层细胞浆细胞核中FasL阳性物质表达较少，呈棕黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。模型组各层细胞浆细胞核中FasL阳性物质表达明显，呈棕褐色，视网膜各层组织细胞结构出现紊乱。口服组和滴眼组各层细胞浆细胞核中FasL阳性物质表达程度明显较模型组减少，呈棕黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。见图2。

2.3 蛴螬提取物对视网膜组织TNF-α表达的影响

空白组视网膜各层细胞浆中TNF-α阳性物质表达较少，呈浅黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。模型组内界膜、神经纤维层、内外丛状层、内颗粒层以及光感受器内节细胞浆中TNF-α阳性物质表达明显增多，呈棕褐色，视网膜内外颗粒层组织细胞结构出现紊乱。口服组和滴眼组各层细胞浆中TNF-α阳性物质表达程度明显较模型组减少，呈棕黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。见图3。

2.4 蛴螬提取物对视网膜组织NF-κB表达的影响

空白组视网膜内界膜、感光细胞外节NF-κB阳性物质少量表达，呈浅黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。模型组内界膜、神经纤维层、内外丛状层以及光感受器外节中NF-κB阳性物质表达较多，呈棕黄色。口服组和滴眼组内界膜、感光细胞外节NF-κB阳性物质少量表达，呈浅黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。见图4。

2.5 各组视网膜Caspase-3、FasL、TNF-α、NF-κB的光密度值检测结果

给药4周后检测，视网膜组织中FasL、TNF-α、NF-κB表达均增强，经蛴螬提取物口服或滴眼后，在一定程度上抑制了其高表达。与空白组比较，模型组视网膜组织中的Caspase-3表达明显下降，FasL、TNF-α、NF-κB表达均增强（P<0.05），口服组和滴眼组组织中各项指标均无显著性差异（P>0.05）；与模型组比较，口服组和滴眼组中Caspase-3表达明显升高，FasL、TNF-α、NF-κB表达明显降低（P<0.05）；与口服组比较，滴眼组中Caspase-3、FasL、TNF-α、NF-κB的光密度值均无显著性差异（P>0.05）。见表1。3 讨论

蛴螬为金龟子幼虫。味咸，微温，有小毒，归肝经。具有破血、行瘀、散结、通乳的作用，可治疗折损瘀痛、痛风、破伤风、喉痹、目翳、丹毒、痈疽、痔漏。含有丰富的氨基酸、多肽或蛋白质、脂肪、外细胞糖酶，蔗糖酶等多种酶；Cu、Mn含量非常丰富，Ca、Mg、Cr、Fe、Zn含量其次，K/Na的比值也很高；B族维生素的含量较高，维生素A和维生素E的含量也较丰富[9]。其药理作用主要有收缩血管、利尿、抗肿瘤、抗菌、保肝等作用。

大量的实验研究发现视网膜感光细胞、神经节细胞、色素上皮细胞均存在细胞凋亡，视网膜的发育过程中神经细胞的凋亡对神经细胞的增生、迁移与死亡发挥着重要的作用，一旦生长与死亡之间的平衡遭到破坏，将导致视网膜的发育异常[10-13]。目前认识的细胞凋亡的通路主要有两条：膜受体通路、细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经。不管那条途径，Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。

本实验结果表明：在光损伤4周后，光损伤活体干性AMD动物模型眼Caspase-3的表达降低，而经蛴螬提取液干预治疗后，其表达又有所恢复，维持到正常水平。而前期研究显示：造模1周后，模型组Caspase-3表达升高，蛴螬提取液可以降低视网膜组织中Caspase-3，两者结果似乎存在矛盾。Caspase-3作为细胞凋亡的效应凋亡蛋白酶，对细胞的凋亡起到承上启下的作用，因此Caspase-3的表达与视网膜感光细胞等细胞凋亡关系密切，其表达程度在一定程度上反应了细胞凋亡程度。本实验结合前期实验证实：在动物眼光损伤初期，存在Caspase-3高表达，光损伤导致感光细胞等细胞凋亡的发生，而在4周后Caspase-3表达受到抑制。这与Lee等[11]研究：特定波长和强度的绿色光源对鼠视网膜的损伤，发现持续光照24 h，感光细胞丧失25%～50%，随光照时间延长，感光细胞丧失，速度明显减慢，直至2～4周后，感光细胞处于稳定状态。几乎一致，即在光损伤早期即出现感光细胞凋亡，到后期感光细胞凋亡维持稳态甚至有所减少。蛴螬提取液在光损伤早期（1周），可以降低Caspase-3的高表达，而在晚期（4周）可以使低的Caspase-3的有所升高，維持正常水平，从而证实蛴螬提取液对感光细胞的凋亡早期有抑制作用，而晚期对细胞凋亡有促进作用，其对视网膜组织的细胞凋亡具有调节维持稳态的作用。也正是这种调节作用使脱落的感光细胞外节及衰老丧失功能的细胞及残杂得以有效清除，维持了视网膜组织原有的新陈代谢、有助于重新恢复细胞死亡与增殖的平衡。

造模4周后，视网膜组织中的FasL、TNF-α、NF-κB表达均明显升高，进一步表明大鼠经视网膜光损伤4周后，FasL、TNF-α、NF-κB并不是通过调控细胞凋亡途径发挥作用，而是共同参与了AMD的慢性炎症过程，FasL、TNF-α、NF-κB作为炎症相关因子的共同升高，也反证了AMD光损伤模型眼存在长期的慢性炎症过程。经蛴螬治疗后，FasL、TNF-α、NF-κB高表达得到了抑制，表明蛴螬提取液对光损伤AMD模型眼慢性炎症过程具有抑制作用，减少了慢性炎症反应对感光细胞及神经细胞的损害。其作用机制可能是通过对膜受体蛋白FasL的影响，进而抑制NF-κB信号通路的活化，减少了巨噬细胞等对TNF-α等炎性因子的释放来实现的。

觀察蛴螬提取物口服和滴眼对光损伤诱导活体干性AMD模型眼的影响，对Caspase-3、FasL、TNF-α、NF-κB等表达的影响效应一致。证实蛴螬提取物滴眼亦能在光损伤早期减轻感光细胞的凋亡，光损伤后期促进细胞凋亡，减轻炎症反应，从而对干性AMD同样具有良好的治疗作用。

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