具群体感应抑制作用短小芽孢杆菌F3—1菌株的诱变育种

彭孟凡 范斌 张庆华 宋增福

摘要：【目的】获得群体感应（QS）信号分子降解能力更强的突变短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），增强其在水产细菌性病害防治中的效果，为水产养殖业利用细菌QS淬灭机制防治细菌性疾病提供借鉴。【方法】以具有降解QS信号分子特性的短小芽孢杆菌F3-1为出发菌株、紫外线和亚硝酸钠（NaNO2）为诱变剂进行诱变选育；以紫色杆菌（Chromobacteria violaceum ATCC12472）为报告菌株筛选正向突变，经连续传代25代后测定其遗传稳定性；采用单因素试验测定培养时间、pH、盐度和温度对突变菌株降解QS信号分子能力的影响，同时通过扩增QS抑制基因aiiA及SDS-PAGE分析验证突变菌株的蛋白表达情况。【结果】两种诱变方法共获得205株突变菌株，以紫色杆菌为报告菌株通过紫外诱变筛选出具有QS抑制作用的正向突变株4株，编号分别为FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1。其中，突变菌株FF1-2的蛋白产量达47.48±2.87 μg/mL，约是出发菌株F3-1的3.12倍，对紫色杆菌的褪色圈直径是出发菌株F3-1的2.96倍，抑制紫色素的能力较出发菌株F3-1提高64%，说明该突变菌株具有很强的QS抑制能力；连续传代25代后，突变菌株FF1-2的产蛋白能力及对紫色素的抑制作用无显著变化（P>0.05）。突变菌株FF1-2在培养时间为40 h、温度30 ℃、盐度0.5%、pH 7.0时，紫色素褪色效果最佳。从出发菌株F3-1和突變菌株FF1-2中均能扩增获得753 bp的aiiA基因，且通过SDS-PAGE分析验证二者在28 kD处均呈现出特异条带。【结论】采用诱变育种技术筛选得到的突变菌株FF1-2能显著提高QS抑制能力，且该抑制能力能稳定遗传，即通过诱变育种技术提高短小芽孢杆菌的产酶量及酶活力具有可行性。

关键词： 短小芽孢杆菌；群体感应（QS）；诱变育种；aiiA基因；紫色杆菌

中图分类号： S942.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1423-09

0 引言

【研究意义】抗生素能大幅度降低水产细菌性疾病的死亡率，但过度使用易导致抗性病原菌形成及病原菌耐药性、多重耐药现象日趋严重（王瑞旋，2007；Verner-Jeffreys et al.，2009）。因此，探索新的细菌性病害防治手段势在必行。群体感应（Quorum sensing，QS）是指细菌自身释放一些小分子化合物，当这些化合物累积到某个阈值时能与特定的受体蛋白结合，开启相关基因的表达（Tang and Zhang，2014）。目前已知大多数革兰氏阴性致病菌存在以N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）为信号分子的QS系统（Koul and Kalia，2017），许多毒力因子的表达均受其直接或间接调控（Surette et al.，1999）。淬灭QS信号分子的作用靶点与传统抗生素完全不同，仅通过阻断信号分子而抑制病原的致病能力，不影响细菌生长，从而避免耐药突变株的出现（Koul et al.，2016）。因此，通过抑制细菌QS系统降低病原菌致病力的策略，为水产细菌性病害防治提供了新思路。【前人研究进展】目前，主要是通过QS淬灭酶降解信号分子，如aiiA基因编码的AiiA蛋白是一类由芽孢杆菌产生的酰基高丝氨酸内酯酶，能专一性降解AHLs信号分子而破坏依赖QS的致病机制，降低病原菌的致病性。Dong等于2000年在蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）中首次发现具有群体感应降解作用的AiiA酶，并证实其具有降解QS信号分子的作用。此后，在多种芽孢杆菌中发现AiiA酶（Dong et al.，2002；Pan et al.，2008；曾世涌等，2013；Vinoj et al.，2014），且研究证实通过生物工程技术手段表达AiiA酶在动植物病原菌防控方面发挥了重要作用（杨梅等，2007；Chen et al.，2010）。尽管通过基因工程可获得较高产量的AiiA酶，但也存在表达系统表达不稳定的问题。Chen等（2010）用毕赤酵母成功表达获得AiiA酶，但使用同样分泌型表达载体，在娄瑞娟等（2010）的研究中并未完全表达出来，其原因可能是酵母表达系统本身的缺陷及重组mRNA中有非编码区和转录阻断而导致某些蛋白表达不理想。利用基因克隆技术能实现降解酶基因在大肠杆菌或毕赤酵母中表达，并提高降解酶的产量和活性，但得到的菌株缺乏稳定性且功能单一，不具备芽孢杆菌的益生作用，加上生产成本偏高，而不利于大规模生产（黄志立等，2001）。诱变育种是非特异性改变菌株特性的一种简便方法，虽然不能像基因工程技术一样对菌株进行定向定点突变，但可通过反复诱变及后期特异性筛选获得目的突变菌株，目前已在菌株性能改良中广泛应用。吕志伟等（2011）通过紫外诱变地衣芽孢杆菌LCB-8得到突变菌株DY-97，其酶活力提高了17%；余祖华等（2016）利用该方法对产纤维素酶地衣芽孢杆菌进行紫外线诱导，并成功获得其突变菌株；吴勇等（2017）以紫外诱变枯草芽孢杆菌BS303，结果获得常温和低温条件下对枯萎病均有很强拮抗能力且能显著降低土壤病原菌数量的菌株。【本研究切入点】利用紫外诱变技术提高菌株的产酶量及酶活力已在地芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中得到广泛应用，但针对短小芽孢杆菌（B. pumilus）的研究很少，尤其利用该技术将芽孢杆菌应用于群体感应抑制作用方面的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】从诱变育种技术角度入手，通过对前期从鲫鱼肠道分离获得且具QS抑制作用的短小芽孢杆菌F3-1（宋增福等，2013）进行诱变选育，以期获得QS信号分子降解能力更强的突变菌株，增强其在水产细菌性病害防治中的效果，为水产养殖业利用细菌QS淬灭机制防治细菌性疾病提供借鉴。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试菌株：短小芽孢杆菌F3-1由本课题组分离保存提供；紫色杆菌（Chromobacteria violaceum ATCC12472）购自美国ATCC公司。主要试剂：亚硝酸钠（NaNO2），二甲基亚砜（DMSO），乙酸乙酯（C4H8O2），甲醇（CH3OH），硫酸铵[（NH4）2SO4]，0.1 mmol/L HCl和0.1 mmol/L NaOH，PCR Master Mix。供试培养基：LB培养基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，瓊脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2）、LB液体培养基（蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4）。主要仪器设备：超净工作台（SW-CJ-IF，苏州净化设备有限公司），高压灭菌器（YXQ-LS-18SI，上海博讯实业有限公司），生化培养箱（SPX-100B-Z，上海博讯实业有限公司），离心机（TDL80-2B，上海安亭科学仪器有限公司），分光光度计（722型，上海精密仪器仪表有限公司），凝胶成像仪[GEL DOC XR，伯乐生命医学产品（上海）有限公司]，小垂直板电泳槽。

1. 2 菌株F3-1诱变育种

1. 2. 1 菌株F3-1生长曲线测定 将活化菌株F3-1以1%的接种量接种于LB液体培养基中，28 ℃下摇床（160 r/min）培养。每2 h测定一次OD600 nm，并绘制短小芽孢杆菌生长曲线。

1. 2. 2 诱变育种及突变菌株筛选 紫外诱变参照夏钱华等（2017）的方法：将1.7×108 CFU/mL的F3-1菌悬液涂布于LB培养基上，于15 W紫外灯下（距离30 cm）分别照射5、10、15、20和25 min后，28 ℃培养24 h，用无菌水梯度稀释后重新涂布于LB培养基上，28 ℃倒置培养。亚硝酸钠（NaNO2）诱变参照Wu等（2013）的方法：接种1.7×108 CFU/mL的F3-1菌悬液于LB液体培养基中，分别加入终浓度为5、10、15、20和25 g/L的NaNO2溶液，28 ℃培养24 h后涂布于LB培养基上，28 ℃继续培养。

突变菌株筛选：以紫色杆菌ATCC12472为报告菌株，将诱变菌株转接至LB培养基中28 ℃培养24 h，10000 r/min离心10 min后过0.22 μm滤膜，收集滤液；吸取滤液滴到滤纸片上，吹干后反扣于涂布有紫色杆菌的LB培养基上，26 ℃倒置培养48 h，依据能否使紫色杆菌紫色素褪去确定阳性突变菌株，并根据褪色圈确定突变效果（Chenia，2013）。

1. 2. 3 突变菌株粗提物对紫色杆菌生长的影响 粗提物制备参照肖支叶等（2017）的方法：突变菌株于28 ℃下摇床（120 r/min）培养6～10 h，超声破碎后用乙酸乙酯萃取，充分振荡后静置过夜，8000 r/min离心20 min，取上层有机相，用旋转蒸发仪（40 ℃）浓缩至干，干燥物用甲醇溶解至100 g/L。稀释紫色杆菌菌液至OD600 nm=0.05，每组试管中加入突变菌株粗提物至终浓度100 mg/L，26 ℃下摇床（120 r/min）培养，以不加粗提物为对照组。每2 h测定一次OD600 nm，检测突变菌株粗提物对紫色杆菌生长的影响。

1. 2. 4 突变菌株粗提物对紫色杆菌紫色素产量的影响 稀释紫色杆菌菌液至OD600 nm=0.05，每组分别加入终浓度100 mg/L的突变菌株粗提物，26 ℃下摇床（120 r/min）培养16 h后测定紫色素含量。紫色素提取参照许嫚（2015）的方法：突变菌株粗提物与紫色杆菌的混合液经12000 r/min离心10 min后，加入DMSO并充分涡旋振荡，再次离心后收集上清液于585 nm波长处测定OD。

1. 2. 5 突变菌株遗传稳定性测定 将诱变后QS抑制效果最强的菌株接种于LB培养基连续传代25代，利用滤纸片法（同1.2.2）每传代5代测定其褪色直径，同时测定蛋白产量及紫色素的OD585 nm，评价菌株的遗传稳定性。其中，胞外蛋白粗提参照余祖华等（2016）的方法：过夜培养的菌液在4 ℃下10000 r/min离心15 min，过0.22 μm滤膜，加入固体硫酸铵至80%饱和度，4 ℃静置过夜后再次离心，以PBS溶解沉淀，即为蛋白粗提液；然后采用Bradford法测定菌株蛋白产量。

1. 3 不同环境下突变菌株对紫色素的抑制能力

1. 3. 1 培养时间 将出发菌株（F3-1）和突变菌株的粗提物分别加入已接种紫色杆菌的LB培养基中，26 ℃培养，每隔2 h取样一次，参照1.2.5的方法提取紫色素并测定OD585 nm。

1. 3. 2 pH 用0.1 mmol/L HCl或0.1 mmol/L NaOH调节出发菌株和突变菌株粗提物的pH分别为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，作用1 h后将pH调至7.0，测定OD585 nm，方法同1.2.5。

1. 3. 3 盐度 用氯化钠配制盐度0.5%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%的培养基，将出发菌株和突变菌株分别接种于上述培养基中，28 ℃培养24 h，测定OD585 nm，方法同1.2.5。

1. 3. 4 温度 按照1.2.5的方法制备粗提物后，分别在20 ℃处理24 h、30 ℃处理24 h、40 ℃处理12 h、50 ℃处理1 h和60 ℃处理30 min后加入已接种紫色杆菌的培养基，测定OD585 nm。

1. 4 QS抑制基因aiiA检测

根据NCBI已公布的aiiA基因序列（EF219409），利用Primer Premier 5.0设计引物。引物序列为：F（5'-ATGGGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTAT-3'）和R（5'-GTCGAATTCCTCAACAAGATACTCCTAA

TG-3'）。PCR反应体系50.0 μL：2×Master Mix 25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行34个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物以1.7%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 5 突变菌株蛋白粗提液SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE分析出發菌株和突变菌株的粗蛋白提取液，方法同1.2.5，并进行凝胶分析仪成像分析。

1. 6 统计分析

试验数据采用SPSS 13.0进行方差分析，并以Turkey进行多重比较分析。

2 结果与分析

2. 1 短小芽孢杆菌F3-1的生长曲线

菌株F3-1的生长曲线如图1所示。经过一段时间的延迟期后，菌株F3-1从第8 h进入对数生长期，其后菌体生长迅速，菌体浓度快速升高；稳定期在培养24～40 h。根据菌株F3-1的生长曲线选取培养20 h的菌体进行诱变处理。

2. 2 突变菌株筛选结果

两种诱变方法共获得205株突变菌株，其中以紫色杆菌ATCC12472为报告菌株通过紫外诱变筛选出具有QS抑制作用的正向突变菌株4株，编号分别为FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1。由表1可知，与出发菌株F3-1相比，4株突变菌株的QS抑制能力均明显提高。其中，突变菌株FF1-2经28 ℃培养24 h的蛋白产量达47.48±2.87 μg/mL，约是出发菌株F3-1（15.2 μg/mL）的3.12倍，二者差异显著（P<0.05，下同），对紫色杆菌的褪色圈直径是出发菌株的2.96倍（图2），即突变菌株FF1-2的诱变效果最佳。

2. 3 突变菌株粗提物对紫色杆菌生长的影响

突变菌株粗提物对紫色杆菌生长的影响如图3所示。将出发菌株F3-1及突变菌株FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-2的粗提物分别加入含紫色杆菌菌液的培养基中，发现紫色杆菌的生长趋势与对照组一致，无显著影响（P>0.05，下同）。

2. 4 突变株粗提物对紫色杆菌产紫色素的影响

4株突变菌株粗提物对紫色杆菌产紫色素有明显影响（图4）。其中，突变菌株FF1-2的OD585 nm显著低于出发菌株F3-1，抑制紫色素的能力最强（图5）。紫色素抑制率（%）=（1-A1/A0）×100。式中，A0为出发菌株F3-1的OD585 nm，A1为突变菌株的OD585 nm。根据该公式计算得出，突变菌株FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1对紫色杆菌紫色素的抑制率分别为64%、42%、33%和47%。

2. 5 突变株转接稳定性检测结果

对QS抑制作用最强的突变菌株FF1-2连续传代25代，每隔5代测定其蛋白含量、对紫色杆菌的褪色直径及对紫色素的抑制能力。结果显示，突变菌株FF1-2在连续传代25代后，对紫色杆菌的褪色能力无明显变化（图6）。由图7可知，传代25代后突变菌株FF1-2对紫色杆菌的褪色直径仍稳定在3.7 cm，蛋白产量稳定在46.7±1.58 μg/mL，对紫色素的降解能力差异不显著，说明该突变菌株的突变特性遗传稳定。

2. 6 不同培养条件下突变菌株FF1-2对紫色素的抑制能力

2. 6. 1 培养时间 随培养时间的延长，出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2对紫色素的抑制作用均呈先升高后降低的变化趋势，在培养24～48 h的抑制作用最佳。出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2均在培养至40 h时对紫色素的抑制作用最强，且突变菌株FF1-2对紫色素的抑制能力约是出发菌株F3-1的3.00倍（图8）。

2. 6. 2 pH 在pH 3.0～11.0的范围内，出发菌株F3-1抑制紫色素的能力受pH变化影响较突变菌株FF1-2的小，二者对紫色素的抑制能力均呈先升高后降低的变化趋势，且在pH 7.0时的抑制能力最强，突变菌株FF1-2对紫色素的抑制能力约是出发菌株F3-1的2.50倍（图9）。

2. 6. 3 盐度 盐度对出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2抑制紫色素能力的影响见图10。当盐度由0.5%升至4.0%时，出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2对紫色素的抑制能力降低，当盐度超过6.0%后曲线趋于平稳。因此，可确定盐度为0.5%时的抑制能力最强，盐度升高则不利于出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2对紫色素的抑制作用。

2. 6. 4 温度 经出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2作用后的紫色杆菌，其紫色素含量在20～30 ℃呈下降趋势，至30 ℃时OD585 nm达最低值，之后呈上升趋势。说明30 ℃为最适合降解紫色素的温度，且突变菌株FF1-2在30 ℃下对紫色素的抑制能力约是出发菌株F3-1的3.00倍（图11）。

2. 7 QS抑制基因aiiA的克隆结果

根据NCBI已公布的aiiA基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，扩增产物以1.7%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果发现出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2均在750 bp附近出现明显条带（图12），测序结果表明其基因片段大小与Dong等（2000）的研究报道一致，即两株菌株的基因序列中均含有753 bp的目的基因片段。

2. 8 诱变前后菌株胞外蛋白SDS-PAGE分析结果

短小芽孢杆菌F3-1诱变前后胞外蛋白的SDS-PAGE分析结果见图13。出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2在28 kD处均呈现出特异条带，其分子量与Easwaran等（2015）的研究报道一致，且突变菌株FF1-2的蛋白表达量明显高于出发菌株F3-1。

3 讨论

诱变育种是微生物的常规育种技术，是以化学或物理手段诱发基因突变，通过筛选突变体，定向寻找正向突变的一项技术。该方法突变率高，在短时间内可获得大量的优良变异类型，且诱变手段多样，操作简便，是实验室研究及工业生产中最常用的优良菌株选育方法（范俊英等，2012；艾冰花等，2015；白豆等，2016）。同时，芽孢杆菌是目前水产上应用最广泛的益生菌，具有易生产、便运输、耐储藏等特点，在调节水质、增强动物机体免疫力、减少病害发生等方面效果显著，是常用的益生微生物菌株（Hong et al.，2005）。本研究以前期筛选出的一株具有QS信号分子降解能力的短小芽孢杆菌F3-1（宋增福等，2013）为出发菌株，通过紫外诱变获得4株突变菌株（FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1），其中，突变菌株FF1-2的蛋白产量达47.48±2.87 μg/mL，约是出发菌株F3-1的3.12倍，对紫色杆菌的褪色圈直径是出发菌株F3-1的2.96倍，抑制紫色素的能力较出发菌株F3-1提高64%，说明紫外诱变获得的突变菌株FF1-2具有很强的QS抑制能力；连续传代25代后，突变菌株FF1-2的产蛋白能力及对紫色素的抑制作用无明显变化，说明该突变菌株的突变特性遗传稳定，为解决利用分子生物学技术中因质粒稳定性差等而导致基因工程菌不稳定的问题提供了参考。此外，从出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2中均能扩增获得753 bp的aiiA基因，且通过SDS-PAGE分析验证二者在28 kD处均呈现出特异条带，但突变菌株FF1-2的蛋白表达量明显高于出发菌株F3-1。根据Easwaran等（2015）、Vinoj等（2015）的研究结果（QS信号分子降解酶AiiA的分子量为28 kD），可初步推测两株菌株的QS抑制作用蛋白可能为AiiA同源酶。

短小芽孢杆菌与其他微生物一样，其产酶活性与培养温度、时间、pH及盐度等条件密切相关。本研究结果表明，突变菌株FF1-2的最佳抑制紫色素时间为40 h，对紫色素的抑制能力约是出发菌株F3-1的3.00倍，在培养24～48 h内抑制能力较强，培养时间超过40 h后抑制能力逐渐下降。这可能是培养24～48 h的菌株已处于对数生长期，菌株生长达到一定浓度，产酶量不断积累，QS抑制能力强，但培养48 h进入衰退期后菌株产蛋白能力有所下降，对紫色素的抑制作用也随之变弱；突变菌株FF1-2在pH 7.0～9.0时对紫色素的抑制能力最强，其抑制能力约是出发菌株F3-1的2.50倍；最适温度为30 ℃，超过50 ℃后菌株诱变前后对紫色素的抑制能力基本一致。此外，出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2对紫色素抑制的最适盐度均在0.5%左右，超过6.0%的盐度对菌株抑制紫色素的影响不明显，对盐度的适应能力高于张美超等（2011）在畢赤酵母菌中克隆表达的AiiA-AIO6酶工程菌。总之，突变菌株FF1-2对紫色素抑制能力的理化因素与AHLs活性的最适条件相统一，可进一步推测SDS-PAGE分析中28 kD处的蛋白条带即为AiiA同源蛋白。

本研究首次通过诱变育种技术筛选出能稳定遗传且对QS信号分子高效敏感的短小芽孢杆菌突变菌株FF1-2，与基因克隆方法相比，诱变育种手段多样，操作简便，能丰富和拓宽菌种的变异类型，尤其是自然界少有的性状变异，增加可利用的基因资源。以此为基础，利用分子克隆手段查找变异位点，确定诱变育种菌株的QS分子机制，可为突变菌株FF1-2的应用打下基础。

4 结论

采用诱变育种技术筛选得到的突变菌株FF1-2能显著提高QS抑制能力，且该抑制能力能稳定遗传，即通过诱变育种技术提高短小芽孢杆菌的产酶量及酶活力具有可行性。

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（責任编辑 兰宗宝）