桑树PDS基因VIGS转化体系的构建与鉴定

李瑞雪 王钰婷 胡飞 夏家凤 汪泰初 赵卫国

摘要：【目的】建立桑树的病毒诱导基因沉默（VIGS）转化体系，为桑树功能基因的分析研究提供技术支持。【方法】以丰驰桑为试验材料，克隆含BamH I和Xba I酶切位点的八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因片段，经Xba I和BamH I双酶切后与烟草脆裂病毒（TRV）连接构建重组病毒载体pTRV2-PDS，转化农杆菌GV3101后通过压迫注射方式侵染桑树幼苗叶片。【结果】克隆获得的桑树PDS基因干扰片段346 bp，与改造后的TRV质粒连接可成功构建携带桑树PDS基因的重组病毒载体pTRV2-PDS。桑树叶片被侵染15 d后，接种重组病毒载体pTRV2-PDS桑树的第二轮真叶开始出现叶片白化现象，侵染20 d后，白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散，叶片呈现明显的白化表型。实时荧光定量PCR检测结果显示，重组病毒载体pTRV2-PDS侵染的桑叶PDS基因相对表达量仅为阴性对照（pTRV2）的58%，二者差异极显著（P<0.01），表明桑树PDS基因表达被有效抑制。【结论】利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因，使桑树叶片呈现明显的白化症状，即可用于后续的桑树功能基因鉴定。

关键词： 桑树；八氢番茄红素脱氢酶（PDS）；病毒诱導的基因沉默（VIGS）；烟草脆裂病毒（TRV）；白化表型

中图分类号： S888.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1432-07

0 引言

【研究意义】病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是近年发展起来的一种转录后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）现象，是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制（Shao et al.，2008），被开发成一种高效、快速研究植物功能基因的反向遗传学新技术（牛义岭等，2016），目前已构建了以DNA病毒、RNA病毒、DNA卫星分子和卫星病毒为载体的VIGS体系（Geuten et al.，2013；王旭等，2016）。与基因敲除、转基因、突变体筛选等植物转基因技术相比，VIGS无需构建转基因植株，具有周期短、操作简便、获得表型快速、成本低等优点，已广泛应用于植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导及生长发育等相关基因功能研究（Zhou and Huang，2012；Kandoth et al.，2013；Pflieger et al.，2013），在植物功能基因组学领域发挥重要作用。【前人研究进展】Kumagai等（1995）将一段八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase，PDS）的cDNA插入烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）基因组上，首次构建了VIGS转化载体并将烟草中的PDS基因成功沉默。PDS是类胡萝卜素合成途径中的关键限速酶之一，常作为评价VIGS是否成功的参照基因（Bennypaul et al.，2012）。在以类胡萝卜素为主要色素的植物中，类胡萝卜素具有光保护作用，若PDS基因被成功沉默，植株幼嫩叶片将呈现出白化症状，表型变化明显，易于观察辨别（Sun et al.，1998）。Ruiz等（1998）将一段PDS基因cDNA插入马铃薯X病毒（Potato X virus，PVX）基因组上，通过根癌农杆菌将重组病毒侵染马铃薯，其叶片呈失去光保护作用的白化效应，因此提出利用PVX通过VIGS可有效沉默植物内源基因，进而鉴定出未知基因的生物学功能。Kjemtrup等（1998）利用番茄金色花叶病毒（Tomato golden mosaic virus，TGMV）构建了以DNA病毒诱导的VIGS体系，并以TGMV DNA-A和TGMV DNA-B构建重组病毒载体，成功沉默镁离子螯合酶的关键基因Sulfur和luc荧光蛋白基因。Ratcliff等（2000）研究发现，利用烟草脆裂病毒（Tobacco ra-ttle virus，TRV）构建VIGS转化体系的重组病毒载体，诱导功能基因沉默的效率和持久性均优于PVX载体，同时TRV本身对受体植物产生的不利症状也轻于PVX。目前VIGS技术已广泛应用于水稻（Kant et al.，2015）、烟草（Li and Yoshikawa，2015）、小麦（Buhrow et al.，2016）、马铃薯（Dobnik et al.，2016）、番茄（Li et al.，2016）和拟南芥（Bilichak and Kovalchuk，2017）等作物上，在刺萼龙葵（Meng et al.，2016）、棉花（Mustafa et al.，2016）和菠菜（Lee et al.，2017）等植物上也有成功报道。【本研究切入点】林木植物因生长周期长、遗传转化难度大，且不易获得转基因植株，致使其功能基因研究进展缓慢，而VIGS技术有望突破这一技术瓶颈，极大促进林木植物基因功能的分析鉴定。苹果、柑橘等植物VIGS体系构建已获得突破，能高效诱导相关功能基因的沉默（Sasaki et al.，2011；Agüero et al.，2012），但在桑树方面至今未见有关VIGS技术的研究报道。【拟解决的关键问题】构建携带桑树PDS基因片段的VIGS重组载体，并通过农杆菌侵染桑树，建立桑树VIGS转化体系，为桑树功能基因的分析研究提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试桑树品种为丰驰桑，其种子由中国农业科学院蚕业研究所保存提供；用于建立VIGS体系的TRV载体（pTRV1和pTRV2）购自苏州凯益生物科技有限公司；根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101自带pMP90质粒，具有庆大霉素、利福平和卡那霉素抗性，由中国农业科学院蚕业研究所桑树遗传实验室保存提供；FastStart Universal SYBR Green Master Mix Kit购自Roche公司，RNAiso Plus、M-MLV（RNaseH-）、Oligo（dT）12～18 Primer、Ex Taq DNA Polymerase、Mini Best Plasmid Purification Kit、DNA Ligation Kit、pMD20-T载体和DNA Marker等购自TaKaRa公司。

1. 2 桑树幼苗培养

丰驰桑种子在无菌水中浸泡1～2 d（4 ℃），然后将浸泡好的桑树种子撒在装有营养土（营养土∶蛭石=4∶1）的塑料盆土层表面，浇透水并覆盖薄层营养土，做好标记，置于光照培养箱中。培养条件：光照周期为白天16 h+黑夜8 h，对应温度为25和22 ℃，空气相对湿度80%。种子发芽后7～10 d，等两片子叶完全展开后进行侵染试验。

1. 3 总RNA提取及PDS基因干扰片段克隆

将桑树嫩叶样品放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮快速充分研磨至粉末状，以RNAiso Plus充分混匀，再根据RNAiso Plus总RNA快速提取试剂盒说明提取总RNA，检测RNA浓度、纯度及其完整性。调整各样品总RNA浓度，按M-MLV反转录试剂盒说明合成cDNA第一链。对桑树PDS基因（XM_010102809.1）、枣树PDS基因（XM_016031629.1）和牛奶子PDS基因（GQ254067.1）进行序列比对，选取三者同源性较高的片段，利用Oligo 7.0设计引物PDS-F1/PDS-R1（表1），且在上、下游引物5'端分别添加BamH I和Xba I酶切位点（下划线部分），以cDNA为模板，进行干扰片段扩增。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，进行30个循环；最后72 ℃延伸5 min。使用PCR产物纯化试剂盒纯化回收PCR产物，具体操作参照试剂盒说明。

1. 4 重组病毒载体pTRV2-PDS构建

采用限制性内切酶BamH I和Xba I同时对PDS基因干扰片段扩增产物和pTRV2进行双酶切，对酶切产物进行切胶回收处理后，用T4 DNA连接酶在16 ℃下连接过夜，然后转化大肠杆菌DH5α，经PCR鉴定后提取阳性质粒进行测序验证。

1. 5 VIGS沉默体系建立

将重组病毒载体pTRV2-PDS、pTRV1和pTRV2（阴性对照）通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，在卡那霉素（50 mg/L）、庆大霉素（25 mg/L）和利福平（25 mg/L）的抗性条件下筛选转化子，PCR鉴定呈阳性的克隆菌液即为GV3101-pTRV2-PDS根癌农杆菌菌液和GV3101-pTRV2根癌农杆菌菌液。将两种菌液接种到含卡那霉素、庆大霉素和利福平抗生素的YEP液体培养基中，28 ℃过夜培养。离心收集菌体，用重悬液[含10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-N嗎啉代乙磺酸（MES），150 μmol/L乙酰丁香酮（AS）]悬浮菌体，调整OD600=1.0左右。涡旋混匀后，室温静置3 h以上，准备侵染。

取等体积的GV3101-pTRV1载体根癌农杆菌重悬液与重组病毒载体GV3101-pTRV2-PDS根癌农杆菌重悬液充分混合，进行注射侵染。选择生长状况良好且长势一致的桑苗，用一次性注射器针头在桑苗子叶背面轻微摩擦制造伤口，然后使用去掉针头的注射器在伤口处通过压迫注射方式将含有重组病毒载体的根癌农杆菌重悬液注入叶片中，每片叶约注入10 ?L，使菌液在叶片中扩散。以注射GV3101-pTRV2农杆菌菌液为阴性对照组，注射不含菌液的重悬液为空白对照组，每组10棵，3次重复。将注射感染后的植株在铁盘中培养，浇足水，黑暗放置1 d后转入16 h/8 h的光照/黑暗周期、25 ℃和80%湿度条件下培养，观察桑树叶片的表型变化。

1. 6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）鉴定

分别从pTRV2-PDS和pTRV2侵染的桑树叶片中提取总RNA并进行反转录，以β-actin为内参基因，采用qRT-PCR对PDS基因的相对表达情况进行定量分析，所用定量引物见表1。qRT-PCR反应体系20.0 ?L：SYBR Green Master Mix 10.0 ?L，PCR Forward Primer（10 ?mol/L）1.0 ?L，PCR Reverse Primer（10 ?mol/L）1.0 ?L，12倍稀释的cDNA模板3.0 ?L，ddH2O补足至20.0 ?L。扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，进行45个循环；72 ℃延伸7 min。然后按照FastStart Universal SYBR Green Master Mix Kit说明在LightCycler 96 well Real-Time PCR System上进行检测，每个样品3次重复。待测基因相对表达量RQ=2-ΔΔCt（姜上川等，2016）。

1. 7 统计分析

所有试验数据采用Excel 2013进行统计整理，并以SPSS 19.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 桑树PDS基因干扰片段的克隆及测序分析结果

以特异引物PDS-F1/PDS-R1扩增含BamH I和Xba I酶切位点的桑树PDS基因干扰片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在350 bp附近出现特异条带，且条带清晰单一（图1），与预期结果相符。纯化回收目的条带并连接至pMD20-T载体上，重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，结果显示成功克隆获得桑树PDS基因干扰片段（346 bp），可用于构建重组病毒载体。

2. 2 桑树PDS基因VIGS重组载体的构建及转化

TRV属于RNA病毒，具有两条RNA链（RNA1和RNA2），改造后的病毒包括分别装载RNA1和RNA2遗传信息的两个独立质粒结构（pTRV1和pTRV2）。其中，pTRV1质粒上的运动蛋白促进病毒在植物体内转运；pTRV2质粒则携带用于沉默目的基因的干扰片段。将扩增获得的桑树PDS基因干扰片段连接至pMD20-T载体上，筛选阳性克隆扩大培养后提取质粒，双酶切作用下将其连接到pTRV2载体上，即构建获得桑树重组病毒载体pTRV2-PDS。图2为桑树重组病毒载体pTRV2-PDS构建流程，含有PDS基因干扰片段、CaMV35S启动子及病毒外壳蛋白CP。通过PCR鉴定和Sanger测序验证，将阳性重组病毒载体pTRV2-PDS通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，经菌液PCR扩增可得到346 bp的目的条带（图3）；经序列比对分析，发现其与桑树PDS基因干扰片段的序列完全一致，说明已成功构建桑树重组病毒载体pTRV2-PDS。

2. 3 侵染接种及叶片白化表型显现情况

以在光照培养箱中萌芽长出两片子叶的桑树幼苗为试验材料，通过压迫注射方式将含重组病毒载体pTRV2-PDS的农杆菌重悬液注入桑树子叶中，叶片侵染后可观察到明显的圆形痕迹，叶面充满液体。侵染15 d后，发现接种重组病毒载体pTRV2-PDS试验组桑苗的第二轮真叶开始出现叶片白化症状（图4-A）；侵染20 d后，白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散（图4-B），说明沉默载体开始发挥作用，PDS基因被成功沉默；而空白对照组和阴性对照组的桑树子叶无任何变化，均未出现白化现象（图4-C和图4-D）。

2. 4 病毒外殼蛋白CP基因的PCR检测结果

采集空白对照组叶片、阴性对照组叶片、重组病毒载体pTRV2-PDS侵染组（PDS-VIGS）叶片，根据TRV的CP基因序列（Z36974.2）设计特异性引物（表1），分别进行病毒CP基因检测，结果发现仅空白对照组的叶片未检测到对应的目的条带，阴性对照和重组病毒载体pTRV2-PDS侵染组的叶片均能检测到预期的目的条带（图5），表明构建的重组病毒载体pTRV2-PDS已在桑树叶片中繁殖传播。

2. 5 桑树PDS基因的qRT-PCR定量分析结果

为进一步检测重组病毒载体pTRV2-PDS的沉默效果，采用qRT-PCR检测桑树PDS基因的相对表达情况。由图6可看出，重组病毒载体pTRV2-PDS侵染组的PDS基因相对表达量仅为阴性对照组的58%，二者差异极显著（P<0.01），表明桑树PDS基因表达被有效抑制。综合桑树叶片白化表型，说明克隆获得的桑树PDS基因正确，且利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默目的基因，可用于后续的桑树基因功能鉴定。

3 讨论

至今，VIGS技术已广泛应用于植物生长发育、器官形成、非生物胁迫、抗病虫害、细胞信号转导及次生代谢等生命进程中的相关基因功能研究，在植物功能基因组学领域发挥重要作用（Nelson et al.，2004）。桑树等林木植物的基因组庞大、生长周期长、遗传转化效率低，且转基因植株难以获得，致使利用常规转基因技术研究桑树基因功能的进展缓慢。为此，本研究将VIGS技术应用到桑树上，旨在建立桑树VIGS转化体系，为桑树功能基因的分析研究提供技术支持，进而加快桑树相关功能基因分析鉴定的进程。PDS基因是类胡萝卜素合成途径的限速酶基因，主要在植物叶片、花朵和果实中表达，当其合成受阻时植物会出现光漂白现象，表型肉眼易观测。因此，构建植物VIGS体系时一般将PDS基因作为报告基因。本研究中使用的TRV在多种植物中尤其是木本植物中均能成功构建重组病毒载体，具有广泛的适应性，且基因沉默效率高、持续时间长、病毒症状较轻（Huang et al.，2012），在一些植物中还可通过种子将沉默的表型遗传给后代，其沉默表型甚至可维持两年（Senthil-Kumar and Mysore，2011）。本研究结果表明，桑树叶片被侵染15 d后，接种重组病毒载体pTRV2-PDS试验组桑树的第二轮真叶开始呈现叶片白化症状，侵染20 d后，白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散，说明沉默载体已开始发挥作用。

目的基因的沉默效率可通过半定量PCR、qRT-PCR及Northern blotting等分子生物学方法进行检测，无论采用何种检测方法，都是将植物内源性表达的mRNA作为检测对象，故引物序列应设计在插入干扰片段以外的目的基因区域，以避免病毒载体携带干扰片段扩增时对检测结果造成干扰（Spitzer-Rimon et al.，2013）。利用qRT-PCR可快速、定量检测目的基因的沉默情况，且灵敏度高，但也有研究报道指出qRT-PCR的检测片段一般在100 bp左右，而沉默过程可能恰好降解产生此类片段，即使将引物序列设计在插入干扰片段以外，其检测结果也不理想（Geuten et al.，2013）。为避免这一问题，本研究在设计qRT-PCR引物时选择将扩增片段设为同时覆盖插入干扰片段和插入干扰片段以外的PDS基因区域，以提高检测的准确性。qRT-PCR检测结果显示，重组病毒载体pTRV2-PDS侵染组的PDS基因相对表达量仅为阴性对照组的58%，二者差异极显著，表明桑树PDS基因表达被有效抑制。综合桑树叶片白化表型，说明克隆获得的桑树PDS基因正确，且利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默目的基因，可用于后续的桑树功能基因鉴定。

4 结论

利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因，使桑树叶片呈现明显的白化症状，即可用于后续的桑树功能基因鉴定。

参考文献：

姜上川，梅超，王小芳，张大鹏. 2016. 拟南芥SOAR1基因响应ABA与渗透胁迫的表达分析[J]. 河南农业科学，45（2）：29-34. [Jiang S C，Mei C，Wang X F，Zhang D P. 2016. Expression analysis of Arabidopsis SOAR1 in response to ABA and osmotic stress[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，45（2）：29-34.]

牛义岭，姜秀明，许向阳. 2016. 番茄GRAS转录因子家族基因SIGLD1的克隆及VIGS载体构建[J]. 基因组学与应用生物学，35（8）：2155-2160. [Niu Y L，Jiang X M，Xu X Y. 2016. Cloning and VIGS vector construction of GRAS transcription factors family gene SIGLD1 from tomato[J]. Genomics and Applied Biology，35（8）：2155-2160.]

王旭，王新果，張朝贤，黄红娟，魏守辉. 2016. 刺萼龙葵PDS基因VIGS载体的构建[J]. 植物保护，42（4）：137-141. [Wang X，Wang X G，Zhang C X，Huang H J，Wei S H. 2016. VIGS vector construction of PDS gene in Solanum rostratum[J]. Plant Protection，42（4）：137-141.]

Agüero J，Ruiz-Ruiz S，Del Carmen Vives M，Velázquez K，Navarro L，Pe?a L，Moreno P，Guerri J. 2012. Development of viral vectors based on Citrus leaf blotch virus to express foreign proteins or analyze gene function in citrus plants[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，25（10）：1326-1337.

Bennypaul H S，Mutti J S，Rustgi S，Kumar N，Okubara P A，Gill K S. 2012. Virus-induced gene silencing（VIGS） of genes expressed in root，leaf，and meiotic tissues of wheat[J]. Functional & Integrative Genomics，12（1）：143-156.

Bilichak A，Kovalchuk I. 2017. Increasing a stable transformation efficiency of Arabidopsis by manipulating the endo-genous gene expression using virus-induced gene silencing[J]. Methods in Molecular Biology，1456：225-236.

Buhrow L M，Clark S M，Loewen M C. 2016. Identification of an attenuated barley stripe mosaic virus for the virus-induced gene silencing of pathogenesis-related wheat genes[J]. Plant Methods，12：12.doi：10.1186/s13007-016-0112-z.

Dobnik D，Lazar A，Stare T，Gruden K，Vleeshouwers V G，?el J. 2016. Solanum venturii，a suitable model system for virus-induced gene silencing studies in potato reveals StMKK6 as an important player in plant immunity[J]. Plant Methods，12：29. doi： 10.1186/s13007-016-0129-3.

Geuten K，Viaene T，Vekemans D，Kourmpetli S，Drea S. 2013. Analysis of developmental control genes using virus-induced gene silencing[J]. Methods in Molecular Bio-logy，975：61-69.

Huang C J，Qian Y J，Li Z H，Zhou X P. 2012. Virus-induced gene silencing and its application in plant functional genomics[J]. Science China. Life Sciences，55（2）：99-108.

Kandoth P K，Heinz R，Yeckel G，Gross N W，Juvale P S，Hill J，Whitham S A，Baum T J，Mitchum M G. 2013. A virus-induced gene silencing method to study soybean cyst nematode parasitism in Glycine max[J]. BMC Research Notes，6：255. doi： 10.1186/1756-0500-6-255.

Kant R，Sharma S，Dasgupta I. 2015. Virus-induced gene silencing（VIGS） for functional genomics in rice using rice tungro bacilliform virus（RTBV） as a vector[J]. Methods in Molecular Biology，1287：201-217.

Kjemtrup S，Sampson K S，Peele C G，Nguyen L V，Conkling M A，Thompson W F，Robertson D. 1998. Gene silen-cing from plant DNA carried by a Geminivirus[J]. The Plant Journal，14（1）：91-100.

Kumagai M H，Donson J，della-Cioppa G，Harvey D，Hanley K，Grill L K. 1995. Cytoplasmic inhibition of carotenoid biosynthesis with virus-derived RNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，92（5）：1679-1683.

Lee J，Cao V D，Kim J，Pamplona R，Ahn J，Cho S K，Yang S W，Riu K Z，Boo K H. 2017. Development of a virus-induced gene silencing（VIGS） system for Spinacia oleracea L.[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology—Plant，（2）：1-7.

Li C，Yoshikawa N. 2015. Virus-induced gene silencing of N gene in tobacco by apple latent spherical virus vectors[J]. Methods in Molecular Biology，1236：229-240.

Li S，Li K，Cao D，Fu D，Zhu H，Zhu B，Luo Y. 2016. Genome-wide analysis of tomato NF-Y factors and their role in fruit ripening[J]. BMC Genomics，17：36. doi： 10.1186/s12864-015-2334-2.

Meng L H，Wang R H，Zhu B Z，Zhu H L，Luo Y B，Fu D Q. 2016. Efficient virus-induced gene silencing in Solanum rostratum[J]. PLoS One，11（6）：e0156228.

Mustafa R，Shafiq M，Mansoor S，Briddon R W，Scheffler B E，Scheffler J，Amin I. 2016. Virus-induced gene silen-cing in cultivated cotton（Gossypium spp.） using tobacco rattle virus[J]. Molecular Biotechnology，58（1）：65-72.

Nelson D R，Schuler M A，Paquette S M，Werck-Reichhart D，Bak S. 2004. Comparative genomics of rice and Arabidopsis. Analysis of 727 cytochrome P450 genes and pseudogenes from a monocot and a dicot[J]. Plant Physiology，135（2）：756-772.

Pflieger S，Mms R，Blanchet S，Meziadi C，Geffroy V. 2013. VIGS technology：An attractive tool for functional genomics studies in legumes[J]. Functional Plant Biology，40（12）：1234-1248.

Ratcliff F，Martin-Hernandez A M，Baulcombe D C. 2000. Technical advance. Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing[J]. The Plant Journal，25（2）：237-245.

Ruiz M T，Voinnet O，Baulcombe D C. 1998. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing[J]. Plant Cell，10（6）：937-946.

Sasaki S，Yamagishi N，Yoshikawa N. 2011. Efficient virus-induced gene silencing in apple，pear and Japanese pear using Apple latent spherical virus vectors[J]. Plant Me-thods，7（1）：15. doi： 10.1186/1746-4811-7-15.

Senthil-Kumar M，Mysore K S. 2011. Virus-induced gene silencing can persist for more than 2 years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato[J]. Plant Biotechnology Journal，9（7）：797-806.

Shao Y，Zhu H L，Tian H Q，Wang X G，Lin X J，Zhu B Z，Xie Y H，Luo Y B. 2008. Virus-induced gene silencing in plant species[J]. Russian Journal of Plant Physiology，55（2）：168-174.

Spitzerrimon B，CanAni A，Vainstein A. 2013. Virus-aided gene expression and silencing using TRV for functional analysis of floral scent-related genes[J]. Methods in Molecular Biology，975：139-148.

Sun Z，Cunningham F X Jr，Gantt E. 1998. Differential expression of two isopentenyl pyrophosphate isomerases and enhanced carotenoid accumulation in a unicellular chlorophyte[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，95（19）：11482-11488.

Zhou X，Huang C. 2012. Virus-induced gene silencing using begomovirus satellite molecules[J]. Methods in Molecular Biology，894：57-67.

（責任编辑 兰宗宝）