植物生理实验教学中叶绿素提取方法比较

徐 敏，刘 君，阿衣古力·阿布都瓦依提

(新疆农业大学 林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

叶绿素是植物生长发育的重要生理指标之一，其含量与植物光合速率、营养状况、光合作用等密切相关，叶绿素含量的测定无论是在生理上还是在品种选育及植物抗性方面的研究都是必测指标[1-2]。叶绿素含量的测定实验是各农业类高等院校大农学相关专业必修课程“植物生理学”实验中的重要组成部分，实验内容涵盖叶绿素的提取、分离、理化性质及定量测定，在叶绿素的定量测定实验内容教学过程中，存在的问题较多，叶绿素含量因提取液和提取时间的不同而存在差异。在实验教学中，采用超市购买的菠菜和油菜作为实验材料，须提前以80%丙酮进行浸泡8～12 h才可将叶绿素完全提取出来。在这个过程中存在一些问题，如学生不能亲自动手进行叶绿素提取操作，丙酮不易购买，实验准备量大等。在叶绿素提取过程中则存在浸提不彻底、浸提时间长且不稳定和叶绿素含量定量测定重复性差等问题。针对以上叶绿素实验教学中存在的问题，本文就实验课中常用实验材料菠菜和油菜从提取方法、提取时间以及浸泡提取剂3个方面进行了研究，找到了在有限的教学学时操作便捷、重复性高、提取效果好的方法，为叶绿素的提取、开发利用和植物生理叶绿素实验教学提供了理论支持[3]。

1 材料与提取方法

1.1 材料、试剂与主要仪器

供试材料为油菜和菠菜，均购自超市，保证材料的新鲜度一致。分析纯试剂为丙酮、乙醇、甲醇和二甲基亚砜。主要仪器包括可见分光光度计(上海棱光S22PC)、单孔八列水浴锅和万分之一电子天平(梅德勒)。

1.2 提取方法

1.2.1 浸提法

采用提取液浸提，选取位置一致的叶片，用潮湿的纱布擦净叶片，避开主叶脉剪成2 mm的细条，分别称取细条0.2 g放入提取液中加塞遮光，称量材料确保天平小数点后两位一致，浸提时间为8 h、16 h和24 h，摇匀，将提取液分别于波长645 nm和663 nm下测定吸光度，重复3次。提取液共6种，其中，单一成分的提取液是95%乙醇和80%丙酮，混合提取液是丙酮乙醇(1∶1)、丙酮乙醇水(4.5∶4.5∶1)、丙酮甲醇(1∶1)和丙酮甲醇水(4.5∶4.5∶1)。以上溶液分别提取摇匀后，将溶液分别于波长645 nm和663 nm下测定吸光度，重复3次。从叶绿素溶液的吸收光谱可以看出6种吸收光谱基本相似，在波长433 nm和664～665 nm处都有明显的吸收峰，在波长570 nm处有一间断跳跃，其他不明显的峰谷所对应的波长也基本相同，如550 nm(谷)、583.4 nm(峰)、604 nm(谷)。故提取液浸提法可以套用Arnon法的计算公式[4]，计算叶绿素含量。

叶绿素a含量为：

Chla=(12.71A663-2.59A645)V/1000/W

叶绿素b含量为：

Chlb=(22.88A645-4.67A663)V/1000/W

叶绿素总含量为：

Chla+Chlb=(8.04A663+20.29A645)V/1000/W

式中，A663、A645分别为相应波长下叶绿素提取液的吸光度，V为提取液体积，W为叶片鲜重，叶绿素含量单位为mg/g。

二甲基亚砜浸提法(DMSO法)是基于Alanetal[5]的方法，用二甲基亚砜(分析纯)在60℃恒温水浴条件下避光浸提实验材料1 h，收集上清液待测。二甲基亚砜法测定吸光度(A)值检测波长为665 nm、649 nm和480 nm，采用以下公式计算。

叶绿素a含量为：

chla=(12.19A665-3.45A649)V/1000/W

叶绿素b含量为：

chlb=(21.99A649-5.32A665)V/1000/W

总叶绿素含量=Chla+Chlb

式中，A665、A649分别为相应波长下叶绿素提取液的吸光度，V为提取液体积，W为叶片鲜重，叶绿素含量单位为mg/g。

1.2.2 研磨法

称量材料选取位置一致的叶片且确保天平小数点后两位一致，用潮湿的纱布擦净叶片，并剪成2 mm的细条备用，分别称取0.2 g放入研钵中，分别用95%乙醇和80%丙酮进行研磨提取，过滤洗涤定容至5 mL，摇匀，避光待测。测定计算方法同上。

1.3 数据分析

数据采用Excel进行处理，SPSS进行方差分析。为方便描述，如表1所示。

表1 编号和提取液及提取时间对应关系

2 结果与分析

2.1 叶绿素提取液及提取时间比较

不同提取液和提取时间下菠菜叶绿素含量如表2所示。表2表明，对于菠菜叶绿素含量的测定用95%乙醇提取，提取时间24 h效果最好，和16 h、8 h存在极显著差异(p<0.01)；80%丙酮进行提取，提取时间24 h效果最好，和16 h、8 h存在极显著差异(p<0.01)，80%丙酮的整体提取效果较差；丙酮乙醇和水混合提取液，提取16 h和24 h菠菜叶绿素含量无明显差异，且和提取8 h差异性显著；丙酮乙醇混合提取液，提取8 h和16 h菠菜叶绿素含量无差异，且和提取24 h差异性显著，比提取24 h效果更佳；丙酮甲醇混合提取液，提取8 h效果最佳，和提取16 h、24 h呈极显著差异(p<0.01)；丙酮甲醇水混合提取液的提取效果在提取8 h、16 h、24 h菠菜叶绿素含量差异性不显著。以上提取液无论是单一提取液还是混合提取液，提取时间均较长。二甲基亚砜法提取法和以上最佳提取液和最佳提取时间具相比性，则可在1 h内达到以上溶液的提取叶绿素的效果。丙酮存在难购买的市场现象，二甲基亚砜易购买。经提取时间、提取量效果、可重复性和购买难易程度的比较，二甲基亚砜法是菠菜叶绿素定量测定的最佳浸提实验教学方法。

表2 不同提取液和提取时间下菠菜叶绿素含量比较

注：大写字母表示差异极显著水平(p<0.01)。

不同提取液和提取时间下油菜叶绿素含量如表3所示。表3表明，对于油菜叶绿素含量的测定单一提取液在提取时间上的效果比较，用95%乙醇提取，提取时间24 h效果最好，和16 h、8 h存在极显著差异(p<0.01)；80%丙酮进行提取，提取时间24 h效果最好，和16 h、8 h存在极显著差异(p<0.01)，80%丙酮的整体提取效果较差。二甲基亚砜浸提法则可在1 h之内达到以上两种单一提取液24 h 的效果。而对于混合提取液在提取时间上的效果比较，丙酮乙醇水混合提取液，整体提取效果较差；丙酮乙醇混合提取液，3个提取时间的总体提取效果均很好，进一步比较而言，提取8 h和16 h菠菜叶绿素含量无差异，比提取24 h效果更佳；丙酮甲醇混合提取液，提取8 h效果最佳，和提取16 h、24 h呈极显著差异(p<0.01)，且提取16 h的效果最差；丙酮甲醇水混合提取液，提取8 h菠菜叶绿素含量差异性和16 h、24 h差异性极显著(p<0.01)，且在提取24 h后油菜叶绿素含量出现显著下降。综合以上比较，二甲基亚砜法是油菜叶绿素定量测定的最佳浸提实验教学方法。

表3 不同提取液和提取时间下油菜叶绿素含量比较

注：大写字母表示差异极显著水平(p<0.01)。

2.2 叶绿素提取方法的比较

本研究中涵盖浸提法和研磨法。在提取菠菜叶绿素中，用95%乙醇研磨法和95%乙醇提取24 h浸提法两种方法提取的菠菜叶绿素含量差异性不显著，而80%丙酮研磨法和80%丙酮提取24 h浸提法两种方法提取的菠菜叶绿素含量存在极显著差异(p<0.01)，80%丙酮研磨法显著优于80%丙酮浸提法。

研磨法和提取液浸提法相比，菠菜叶绿素含量存在极显著差异(p<0.01)，根据混合提取液的成分和比例的不同，提取效果及可重复性表现不同，有的优于研磨法而有的则相反。

浸提法操作简便，但耗时较长，研磨法操作繁琐，操作时间较短，而二甲基亚砜法融合了两者的优点，操作简便，耗时较短且与研磨法的提取效果不存在显著性差异，且重复性很好，极适合在菠菜叶绿素定量测定的实验教学中推广使用。

在提取油菜叶绿素中，用95%乙醇研磨法和95%乙醇提取24 h浸提法两种方法提取的油菜叶绿素含量差异性不显著，95%乙醇研磨法显著优于95%乙醇提取8 h、16 h浸提法。而80%丙酮研磨法和80%丙酮提取24 h浸提法两种方法提取的油菜叶绿素含量存在极显著差异(p<0.01)，80%丙酮研磨法显著优于80%丙酮浸提法。

研磨法和混合液浸提法相比，油菜叶绿素含量也存在极显著差异(p<0.01)，根据混合提取液的成分和比例的不同，提取效果及可重复性表现不同，有的优于研磨法而有的则相反。二甲基亚砜浸提法是油菜叶绿素定量提取测定的最佳方法。

3 讨论与结论

使用单一提取液提取菠菜叶绿素的最佳提取液是二甲基亚砜，提取时间1 h，提取效果最差的单一提取液是80%丙酮，提取时间是8 h。有研究表明二甲基亚砜的提取效率高于80%丙酮[6]。使用混合浸提液提取菠菜叶绿素的最佳混合提取液是丙酮甲醇混合提取液，提取时间是8 h，其次是丙酮甲醇水混合提取液，浸提时间是8 h。单独用丙酮或乙醇浸提速度不及混合液提取，表明丙酮与甲醇(乙醇)存在协同萃取效应[7]。这与文献[7]在玉米叶绿素含量测定方法研究中结论一致。

综合而言，同种提取液在提取效果一致的基础上，提取时间越短越好。所以用提取法提取油菜叶绿素的最佳提取液为丙酮乙醇混合液、丙酮甲醇混合液或者丙酮甲醇水混合液，提取时间是8 h效果最佳，三者之间不存在差异性。与文献[1]在两种叶绿素提取方法的比较研究中得出的“提取时间以18 h为佳”结论不尽一致。由此分析，混合提取液的提取效果显著好于单一提取液，提取时间根据材料而异。

4 结束语

两种叶绿素提取方法中，二甲基亚砜浸提法和研磨法用时较短。研磨法因需研磨、过滤或离心，且操作繁琐，使用实验器皿较多，会造成少量叶绿素浪费，实验者研磨程度会对叶绿素含量的测定产生影响，重复性较差。二甲基亚砜法用时短，操作简便且重复性好，二甲基亚砜稍有特殊臭味，经毒性试验，有极微弱毒性，毒性低于丙酮。近年来已作为医药用辅助剂及药载剂，故在一般情况下对人体无影响[8]。对DMSO适合叶绿素定量测定的实验教学，叶绿素提取过程只需要1 h，学生可充分利用时间进行叶绿素的分离和理化性质实验，使用二甲基亚砜法有利于统筹安排宝贵的课堂时间。该方法已在新疆农业大学13个专业21个班级近800名学生植物生理学叶绿素实验教学中推广使用。

而在野外叶绿素实验中，研磨法操作步骤繁琐，实现性较差。野外叶绿素实验浸提法则很便捷，将一定量的材料称好后剪碎直接放入提取液中，遮光带回实验室进行测定。二甲基亚砜法提取时间较短，虽然二甲基亚砜黏性大，在低于19℃的环境中极易结晶，受温度影响较大[9]。但实验室常年温度在25℃左右，不存在结晶的问题，所以二甲基亚砜法在叶绿素实验教学中最为适用，菠菜和油菜叶绿素在60℃的二甲基亚砜中提取速度快，可在规定的2个实验教学学时中提取彻底并完成测定，且叶绿素性质稳定，提取的叶绿素含量重复性好。二甲基亚砜法因叶绿素稳定性好[10]，操作简便，易购买携带，提取效果稳定，同样适用在温度不低于19℃野外叶绿素实验[11-12]中。