饮上用坑道储存水对大鼠胃肠功能的影响

杨 波，吴有军，王 颐，吕 刚，孙永胜

坑道不仅在战时可发挥重要的隐蔽和防御作用，在平时也是某些部队日常作业施工乃至饮食起居的场所，由于我国疆域辽阔且山地和海岛众多，因此过去数十年中我军在各地修筑了大量此类工事，这些坑道中有相当一部分至今仍在使用[1]。为明确长期坑道生活条件对官兵胃肠道功能和发病的影响，我们利用大鼠动物模型开展了相关实验，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 坑道储存水 2015-06赴驻京某坑道部队，将官兵日常饮用水盛放在若干容积约30 L的塑料桶中，敞开放置于坑道内，在1、3、6周时分别取出用于喂养大鼠。

1.2 水质检测 由原总参卫生防疫队完成，根据《GB/T5750-2006生活饮用水标准检验方法》检测水质指标30项，检测结果根据《GB5749-2006生活饮用水卫生标准》进行判定。

1.3 动物模型 选用雌性Sprague-Dawley大鼠(6～8周龄)40只，随机分为4组，每组10只，在SPF条件下饲养，饮水使用上述日常饮用水(对照组)和1、3、6周坑道储存水(实验组)，均经加热煮沸处理，分别饲喂2周，而后处死进行下一步实验。

1.4 胃液pH值检测 SD大鼠禁食48 h，不禁水，颈椎脱臼法处死大鼠，沿腹中线解剖大鼠，充分显露胃，用血管钳分别夹闭贲门部及幽门部，用组织剪沿胃小弯侧剪开约1 cm开口，抽取胃液，用广泛和精密pH试纸(北京化工厂)检测。

1.5 PGE2检测 抽取胃液后，楔形切取约0.5 cm×0.5 cm胃壁，剥离黏膜，将其放入匀浆机中匀浆后，按9 ml PBS/g(PBS浓度为0.1 M，PH为7.4)加入PBS，将样本放入试管进行离心，3000 r/min×5 min，取上清放入EP管后-80 ℃保存备用。使用PGE2 ELISA试剂盒(YAD9116，北京雅安达生物技术有限公司)检测PEGE2浓度。

1.6 粪便球杆比 颈椎脱臼法处死大鼠，沿腹中线解剖大鼠，充分显露结直肠，于结直肠处取少量粪便放于无菌试管中，由我院检验科检测其球杆比。具体步骤：涂片→晾干、固定→龙胆紫液10 s→碘溶液10 s→脱色溶液15 s→沙黄溶液10 s→100倍油镜下观察。

1.7 胃黏膜细胞S期和凋亡百分比 (1)单细胞液制备：①将胃黏膜放入0.5%的胰酶溶液试管中；②将试管置入37 ℃恒温水箱中30～40 min，并不断吹打，使细胞脱落、分散；③用200目细胞筛收集胃黏膜细胞，每次收集细胞不少于106个，PBS液反复吹打，离心10 min(1000 r/min)，重复3次以去除消化酶液；④加入80%冰乙醇固定，-80 ℃温度保存留用。(2)PI法(碘化丙啶法)染色：①取标本1000 r/min离心，弃上清；②加入1 ml冰预冷的PBS液，离心，弃上清；③加入细胞周期试剂盒中A试剂(破膜)250 μl，用手轻摇混匀，放置10 min；加入B试剂(固定)250 μl，用手轻摇混匀，放置10 min；加入C试剂(PI)200 μl，用手轻摇混匀，避光放置10 min；④用流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1 水质变化情况 对该部队日常饮用水和在坑道中分别储存1、3、6周的水进行水质检测(每组6份水样)，发现感官性状指标、一般化学指标、毒理学指标及细菌学指标中的总大肠菌群均无明显变化，而细菌总数随时间逐渐升高，在饮用水、储存1、3、6周水组分别为(37.4±12.4) cfu/ml、(83.6±17.3 )cfu/ml、(151.7±25.6) cfu/ml和(242.3±34.3 )cfu/ml，其中储存3、6周的水明显超出国家标准范围(≤100 cfu/ml，表1)。

比较指标饮用水储存时间1周3周6周胃液pH值3.05±0.183.19±0.313.74±0.772.48±0.57胃黏膜PGE2水平(mg/L)427.04±27.81440.56±25.14437.30±34.07385.43±31.28粪便球杆比1/3.45±2.241/3.05±2.341/3.75±2.071/3.65±2.03S期细胞百分比(%)3.32±0.173.37±0.284.46±0.614.19±0.76胃黏膜凋亡细胞百分比(%)0.17±0.130.28±0.150.41±0.110.59±0.17

2.2 大鼠相关指标 4组间大鼠粪便球杆比无统计学差异。储存3周小组胃液pH值高于饮用水组和储存1周水组，储存6周水组低于前三组，差异有统计学意义(P<0.05)；储存6周水组胃黏膜PGE2低于其他三组，差异有统计学意义；储存3周水组和储存6周水组胃黏膜S期细胞百分比高于其他两组，储存3周水组凋亡细胞百分比高于饮用水组，储存6周水组高于其他三组，差异均有统计学意义(P<0.05，表1。)

3 讨 论

坑道具有阴暗、潮湿、低温，以及空气流通差的特点，长期在此种环境下工作生活可危害身心健康，包括引发一些消化系统疾病[2]，但是关于储存水在其中所发挥的作用尚不明确，既往已有研究表明水在坑道中储存可发生细菌学和真菌学方面的改变[3]，考虑到坑道作业官兵通常需要较长时间饮用这种储存水，特别是在战时，因此我们推测饮用坑道储存水可能是影响官兵胃肠道疾病发生的重要因素之一。

坑道驻训官兵饮水来源根据坑道类型和规模不同差异较大，某些大型坑道系统可采集地下水或建有大容量蓄水池，根据该坑道部队实际情况，本研究中我们使用日常饮用水作为储存水的来源。另外从理论上说盛水容器应该严格密闭，这样可以防止污染保证水质，但实际由于使用人数较多，很难做到这一点，因此本研究中我们将水敞开放置于坑道中。基于上述考虑本研究结果能够较好地用于指导此类坑道部队的卫生防病工作。

我们发现储存水对大鼠胃液pH值具有显著影响，表现为饮用储存3周水的大鼠胃液pH值明显上升，而饮用储存6周水的大鼠胃液pH值明显下降，反映出胃黏膜壁细胞的泌酸功能紊乱，分析原因pH值上升可能是壁细胞受有害因素损伤导致细胞数量或泌酸量减少，pH值下降则可能与细胞代偿性增生或功能增强有关。胃液pH值变化可进一步产生以下效应：一是影响食物消化吸收；二是胃内某些细菌如革兰阴性杆菌和幽门螺旋杆菌含量发生改变[4]，继而促进胃肠道疾病的发生；三是直接对胃黏膜造成损害。我们还测定了饮用不同时长坑道储存水的大鼠胃黏膜组织PGE2含量，结果显示PGE2水平在饮用储存6周水的大鼠显著降低，而PGE2是胃黏膜的重要保护因子，说明饮用储存水可能通过降低PGE2进而造成胃黏膜损害，导致相关疾病例如胃功能障碍、消化性溃疡等的发生。当然我们也注意到，具有统计学差异的PGE2降低仅在大鼠饮用储存6周的水时才出现，这在平时或一般情况下虽然不太可能发生，但是在战时或一些特殊情况下是有可能出现的，我军许多坑道也建有可容纳数吨乃至数十吨水的大型储水池以备人员长期饮用[5]。

与上述发现一致的是在饮用储存3周和储存6周水的大鼠中，胃黏膜S期和凋亡细胞比例均出现了明显上升，S期是细胞合成DNA为下一步分裂做准备，从一定程度上反映细胞的增殖状态，这说明饮用储存水后，胃黏膜细胞在有害因素作用下同时发生了过度增生和死亡，这种情况长期持续将为细胞癌变创造有利条件[6]。另外我们注意到粪便球杆比在各组间无统计学差异，说明饮用坑道储存水对肠道菌群可能没有显著影响。

我们检测了不同时长的坑道储存水的水质以明确胃肠功能损害的可能因素，发现随着储存时间延长，坑道储存水的变化主要是细菌总数升高，而在感官性状、化学物质和毒理学指标方面无明显改变，但在本研究中，为尽可能模拟实际情况，我们对所有水样均进行了煮沸杀菌处理，因而可以排除微生物本身造成的胃黏膜损害，说明在坑道环境下还存在其他能够污染饮水并造成胃黏膜损伤的因子，根据文献报道，真菌及其毒素对坑道储存水的危害也不容忽视[7]，已知多种真菌毒素对人体有致病作用，且相当一部分具有较强的耐热特性，一般的烹调过程均不能将其破坏[8]，例如黄曲霉素需加热到280 ℃才发生裂解，赭曲霉素为134 ℃，单端孢霉烯族类化合物在200 ℃以上。此外，本研究仅对水质的常规指标进行了检测，而重金属等非常规指标由于条件所限未有涉及，这部分可在未来的研究中加以完善。

以上结果说明坑道储存水即使经过煮沸杀菌处理仍然能够对胃黏膜造成损害，这或许是由于其中存在某些耐热的细菌或真菌毒素[3，8]，当然也不排除坑道内一些特殊物质包括重金属、矿物质等随施工粉尘进入水中[9]，对此一方面有必要继续进行深入研究，另一方面也提示我们应尽可能采取其他有效措施，例如盛水容器严格密封防止水受污染、勤于更换新鲜饮用水、加强水质净化处理、尽量不饮用储存时间较长的水，以保障官兵饮水安全和部队战斗力。