云南普洱茶产地微量元素的指纹溯源

林昕，王丽，兰珊珊，魏茂琼，沙凌杰，尹本林，杜丽娟，刘宏程

（农业部农产品质量安全风险评估实验室（昆明），云南省农业科学研究院质量标准与检测技术研究所，云南昆明650223）

普洱茶是以云南地理标志保护范围内的大叶种晒青茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定的加 工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶[1]。素以“降血脂、降血糖、减肥”等独特功效享誉海内外。但普洱茶市场存在以次充好、以新充旧、假冒名牌和蒙骗顾客等多种问题，严重影响了普洱茶产业的健康发展。为了保障普洱茶品质，首先还得从普洱茶原料选配上入手，保证不同地域普洱茶原料的可追溯性[2]。“农产品溯源技术”[3]是建立于农产品生产、加工、贮运、销售和消费过程的信息记录和信息追溯体系，即从“农田到餐桌”的过程跟踪或从“餐桌到农田”的源头追溯技术，主要通过分析表征不同地域来源农产品的特异性指标，建立起能区分农产品产地来源的特征指纹图谱，从而对不同种类农产品进行产地溯源。目前普洱茶产地溯源技术主要是利用微量元素含量结合化学计量学工具判别，如吕海鹏等[3]基于8种含量存在显著差异元素对4个普洱茶产区的普洱茶进行了成功判别；刘宏程等[4]基于普洱茶3个产区中普洱茶生茶和普洱茶熟茶的稀土含量差异性，对不同产地的普洱生茶和普洱熟茶进行了识别；林昕等[5]基于古树普洱茶和台地普洱茶中稀土元素含量差异性，成功地区分了古树普洱茶和台地普洱茶，林昕等[6]基于36种微量元素的差异性，成功对三大主产区的普洱茶进行了识别。在上述研究中，都是通过微量元素进行溯源分析，缺乏结合土壤环境因子对判别模式的进一步验证。因此，本文通过测量不同地域的普洱茶及其茶园土壤中微量元素，为普洱茶的产地溯源、原产地保护以及判别等提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

普洱茶样品采集自云南省西双版纳州、普洱市和临沧市的种植生产一体化企业，茶叶样品分为2类，分别是普洱茶生茶（简称生茶）和普洱茶熟茶（简称熟茶），制茶原料为 2015年春茶，加工时间为 2015年，品质为一级。总计普洱茶样品56个，西双版纳州样品合计16个（其中普洱生茶10个，普洱熟茶6个）；普洱市样品合计20个（其中普洱生茶12个，普洱熟茶8个）；临沧市样品合计20个（普洱生茶10个，普洱熟茶10个），共计普洱生茶32个，普洱熟茶24个，土壤样品共采集24个，土壤样品均来源普洱茶样品原料的种植茶园。详细采样信息见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 仪器与试剂

表1 ICP-MS仪器操作条件Table 1 Operating condition of ICP-MS

电感耦合等离子体质谱仪ELAN9000DRC-e型，美国珀金埃尔默仪器公司；含有 Re、Rh、In的混合内标液（50 μg/mL），含有 Ba、Be、Ce、Co、Li、Mg、Rh、U的调谐液（10 μg/mL），购于美国珀金埃尔默仪器公司；浓硝酸、高氯酸(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2.2 样品前处理和检测方法

茶叶样品中微量元素和稀土元素的检测，参照国家标准GB/T 30376-2013[7]《茶叶中铁、锰、铜、锌、钙、镁、钾、钠、磷、硫的测定-电感耦合等离子体原子发射光谱法》和国家标准GB 5009.94-2012[8]《植物性食品中稀土元素的测定》的要求进行样品前处理及检测，总计测定了茶叶中 14种微量元素（锰(Mn)、铁(Fe)、锌(Zn)、铜(Cu)、镍(Ni)、铅(Pb)、铬(Cr)、钴(Co)、锂(Li)、硒(Se)、镉(Cd)、钼(Mo)、砷(As)和铍(Be)）和16种稀土元素（镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钪(Sc)和钇(Y)）。

茶叶样品前处理：将样品粉碎后，精密称取0.5000 g于50 mL烧杯中，加入高氯酸1 mL和硝酸10 mL，加盖并浸泡过夜后，在电热板上于180 ℃消化8 h左右至试液呈无色透明，当烧杯内开始出现白烟时，取下冷却，然后加入1 mL硝酸复溶，用水定容至25 mL，按仪器工作条件进行测定。同时做空白试验和平行试验。

土壤样品参考《土壤环境检测技术规范》(HJ/T 166-2004)[9]，参考辛文峰等人[10]和乐淑葵等人[11]的方法，采用湿法分解：将土壤粉碎后，精确称取0.1000 g于50 mL烧杯中，加入氢氟酸-高氯酸-硝酸（1:1:10），于电热板上加热溶解，转化为待测溶液，采用ICP-MS法分析目标元素的含量。

1.3 数据处理

所有元素值在统一浓度后(mg/kg)，进行均值和标准差分析；为消除元素含量间差异性，需对数据进行标准化预处理，将数据阵中各元素减去该列元素的均值后再除以该列元素的标准偏差，经过标准化预处理的变量(每种元素)权重相同，均值都为0，方差或标准偏差均为1。

利用方差分析和 Duncan多重比较分析茶叶样品和土壤中元素在地域间的组成差异；利用相关分析研究茶叶和土壤中元素的组成关系；利用Fisher线性判别分析（linear discrimination analysis，LDA）评估元素对茶叶产地溯源鉴别的有效性，并通过交叉验证法（留一法）对判别模型的可靠性进行验证。上述均通过IBMSPSSModeler14.1软件实现。

2 结果与分析

2.1 不同地区普洱茶微量元素和稀土元素含量差异分析

2.1.1 普洱茶中微量元素含量差异分析

从表2中可知，普洱茶三大产区（西双版纳、普洱和临沧）熟茶中14种微量元素含量顺序为：Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Pb、Cr、Co、Li、Se、Cd、Mo、As和 Be，统计分析表明：Mn、Fe、Zn、Pb、Co、Cd和As 7种元素含量在不同产区之间不存在显著性差异，其他7种微量元素中，Cu、Sr两种元素在三大普洱茶产区的熟茶中存在两两显著性差异；Li、Se、Mo和 Be四种元素在西双版纳和普洱产区不存在差异，而与临沧产区存在差异性，Sr、Ni两种元素在三大普洱茶产区存在显著性差异。

普洱茶三大产区的生茶中 14种微量元素含量顺序为：Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Pb、Cr、Co、Li、Se、Cd、Mo、As和Be，统计分析表明：Mn、Fe、Zn、Cu、Cr、Co、Se和Cd 8种元素含量在三大产区之间不存在显著性差异；其他7种微量元素中，Sr和Be两种元素在西双版纳和普洱产区不存在差异，而与临沧产区存在差异性；Li、Mo和As三种元素在临沧和普洱产区不存在差异，而与西双版纳存产区在差异性；Ni和Pb两种元素在三大普洱茶产区的生茶中存在两两显著性差异。

2.1.2 普洱茶中稀土元素含量差异分析

从表3中可知，普洱茶三大产区的熟茶中16种稀土元素含量顺序为：Ce、La、Nd、Y、Sc、Pr、Gd、Sm、Dy、Yb、Er、Eu、Tb、Ho、Lu 和Tm；统计分析表明：熟茶中的稀土元素含量在西双版纳和临沧两个产区之间存在显著性差异（p＞0.05）。而除了 Ce、Er和Sc三种稀土元素在普洱与西双版纳产区之间显著差异。在熟茶中稀土元素 Ce含量最高，最低含量的稀土元素是Lu和Tm。

普洱茶三大产区的生茶中 16种稀土元素含量顺序为：Ce、La、Nd、Y、Sc、Pr、Gd、Sm、Dy、Yb、Er、Eu、Tb、Ho、Lu和Tm；统计分析表明：在生茶中轻稀土组元素（La、Ce、Pr、Nd、Sm和Eu）含量在西双版纳和临沧两个产区之间存在显著性差异（p＞0.05），而西双版纳和普洱两个产区之间不存在显著性差异。

表2 三大产区普洱茶中微量元素分析Table 2 Content of mineral elements in Pu-erh tea and Sun-dried green tea

表3 三大产区普洱茶中稀土元素含量分析Table 3 Content of the rare earth elements in Pu-erh tea and Sun-dried green tea

2.2 茶园土壤中的微量元素和稀土元素含量差异分析

从表4中可知，普洱茶园土壤中14种微量元素含量顺序为：Fe、Mn、Cr、Zn、Cu、As、Li、Ni、Pb、Co、Be、Mo、Se和Cd。土壤中Fe和Mn元素的高含量，从侧面说明，茶树是喜欢酸性土壤，因为在酸性土壤能为茶树提供更高活性的Fe和Mn元素。经过统计分析，Cr、Cu、Li、Ni、Co、Be、Mo 和 Cd 八种元素含量在不同产区之间不存在显著性差异（p＞0.05），Se元素在三个茶叶产区的土壤之间存在显著性差异（p＜0.05），Ni元素在三个茶叶产区的土壤之间不存在显著性差异（p＞0.05），Fe元素在三个茶叶产区的土壤中则是两两存在差异性，Mn、Zn、As和Pb四个元素在在西双版纳和普洱产区不存在差异，而与临沧产区存在差异性。从表 4中可知，As元素含量为 6.78～29.94 mg/kg，符合《土壤环境质量标准》（GB 15618-1995）[12]中一级标准要求（As≤40 mg/kg）；Pb含量为20.68～27.22 mg/kg，符合《土壤环境质量标准》（GB 15618-1995）中一级标准要求（Pb≤35 mg/kg）；Cd 含量为 0.07～0.11 mg/kg，符合《土壤环境质量标准》（GB 15618-1995）中一级标准要求（Cd≤0.20 mg/kg）；Cr含量为 83.65～104.03 mg/kg，符合《土壤环境质量标准》（GB 15618-1995）中二级标准要求（Cr≤90 mg/kg）。从表4中可知，普洱茶园土壤中16种稀土元素含量顺序为：Ce、La、Nd、Sc、Y、Pr、Sm、Gd、Dy、Yb、Er、Eu、Tb、Ho、Lu和Tm；经过统计分析，Eu和Sc两个元素在三个茶叶产区的土壤中则是两两存在差异性，其余14个元素则是在在西双版纳和普洱产区不存在差异，而与临沧产区存在差异性。

2.3 普洱茶产地溯源分析

基于普洱茶中微量元素作为普洱茶产地溯源指标，构建对云南省普洱茶三大产区（西双版纳、普洱和临沧）的样品进行产地判别模型，从而构建了一个30×54的数据矩阵，从而满足进行产地溯源的大数据集要求。利用Fisher函数、交叉检验和采取线性判别法进行普洱茶三大产区判别分析，结果见表5。判别结果表明：对普洱茶产地的识别率是识别率94.6%，交叉检验识别率71.4%。说明：以普洱茶中30种微量元素为产地溯源指标，可以构建普洱茶产地识别模型，对普洱茶三产区的茶样进行产地溯源识别，但是由于元素指标太多，对普洱茶产地的识别造成了识别信息不集中，所以出现交叉检验识别率71.4%，因此，需要从30种微量元素中筛选出适宜作为产地溯源指标的特征地域性元素。

表4 三大普洱茶产区土壤微量元素与稀土元素含量Table 4 Elemental concentrations in soil samples from three regions

2.3.1 普洱茶产地溯源特征元素的筛选

主成分分析(Principal Components Analysis，简称PCA)是将多指标简化为少量综合指标的一种统计分析方法，用少数变量尽可能多的反映原来变量的信息[13]，保证原信息损失小且变量数目尽可能少。设X=(X1，X2，…，Xp)′是p维随机向量，它的线性变化如下：

PC1=a1′X=a11X1+ a21X2+…+ap1Xp

PC2= a2′X= a12X1+ a22X2+…+ap2Xp

PCp= ap′X= a1pX1+ a2pX2+…+appXp

采用新变量PC1来替代原来p个变量X1，X2，…，Xp，PC1应尽可能多的反映原变量信息，如果第一主成分不足以代表原变量的绝大部分信息，考虑引入第二主成分PC2，依次类推。主成分分析的主要目的就是简化数据，因此在实际应用中不会取p个主成分，通常选用m（m＜p）个主成分。主成分个数m要依据各个主成分累计方差贡献率来最终判定。

式中：λ为各个主成分对应的特征值；k为选定的主成分数；i为全部主成分数。通常累计贡献率献率达到80%～90%时[14]，就可以用主成分代替原始变量做进一步的分析。 采用主成分分析对30×54的数据矩阵进行降维处理，选取特征值大于1的成分作为主成分，共提取了6个主成分，总计贡献率为79.82%，以接近主成分贡献率80%要求，可以视为达到了反映普洱茶产地原始数据信息的目的。前6个主分成分，PC1贡献率为50.72%，PC2贡献率为8.177%，PC3贡献率为7.11%，PC4贡献率为5.362%、PC5贡献率为4.251%和PC6的贡献率为4.202%。

图1 第1、2、3主成分得分图Fig.1 Scatter plot of PC1, PC2 and PC3

以主成分PC1、PC2和PC3得分作3D图（图1），可以直观看出普洱茶三大产区的普洱茶熟茶和生茶可以被标识出。相同产地的普洱熟茶和生茶聚居在一起，这说明可以从微量元素与稀土元素中筛选出用于溯源不同普洱茶产区的特征元素，用于构建普洱茶产地的溯源模型。从表6可以看出，PC1主要由16种稀土元素（La、Ce、Nd、Sc、Y、Pr、Sm、Gd、Dy、Yb、Er、Eu、Tb、Ho、Lu和Tm）和Se元素构成，PC2主要由Li和Ni元素构成，PC3主要由Zn、Fe、Cu和Mn元素构成，共计23种元素可以作为普洱茶产地溯源模型的特征矿质元素等待做进一步的筛查和分 析。

表5 不同地区普洱茶样品识别分析结果Table 5 Classification with discriminant analsis of Pu-erh tea samples from different regions

表6 普洱茶中元素的特征向量及累计方差贡献率Table 6 The eigenvenctors and cumulative contribution of Pu-erh tea elements of the principal components

Fe -0.056 -0.293 0.579 0.18 0.064 -0.351 方差贡献率/% 50.720 8.177 7.110 5.362 4.251 4.202 累计贡献率/% 50.720 58.897 66.006 71.369 75.620 79.822

2.3.2 普洱茶产地溯源特征元素的逐步判别分析

为了进一步了解 23种元素中那些元素可以作为普洱茶产地溯源指标。对Sc、Y、La、Ce、Pr、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Nd、Ni、Cu、Zn、Se、Fe、Mn和Li 23种元素进行逐步判别分析，筛选出对地域判别有效的变量，剔除不必要的干扰变量，建立判别模型。逐步判别分析（Stepwise Discriminant Analysis，SDA）是数理统计中一种比较成熟的方法。逐步判别结果表明：La、Ce、Pr、Sm和Se 5种元素先后被引入到判别模型中，构成普洱茶三产区的产地判别模型：

Y 西双版纳=-42.43XLa-15.0XCe-50.36XPr-84.76 XSm+84.96XSe-28.95

Y 普洱=-57.46XLa+10.11XCe+94.1XPr-38.13XSm+ 86.98XSe-8.68

Y 临沧=-48.75XLa+42.12 XCe-37.25 XPr-0.91XSm+ 78.82XSe-18.29

利用此判别模型对样品分类，并结合“留一法”对样品进行回代检验和交叉检验分析，回代检验识别率94.6%，交叉检验识别率89.3%（表7）。此结果与基于30种微量元素构建的普洱茶产地识别结果相比较，初始识别率相同，但是交叉检验识别率由71.4%提高到了89.3%，表明：可以将La、Ce、Pr、Nd、Sm和Se 5种元素作为普洱茶三大产区判别指标。这一结果说明：La、Ce、Pr、Nd、Sm和Se 5种元素是区别不同产地普洱茶的特征元素。

表7 不同地区普洱茶样品识别分析结果Table 7 Classification with discriminant analsis of Pu-erh tea samples from different regions

2.3.3 普洱茶和土壤中同种元素的相关性分析

为了进一步了解La、Ce、Pr、Nd、Sm和Se 5种元素能否是合适作为普洱茶产地溯源模型的特征元素。分别进行了对生茶与土壤、熟茶与土壤中元素含量进行Pearson相关分析，结果如表8所示。

La、Ce、Pr、Nd、Sm和Se 5种元素都呈现正相关性，其中Ce元素则呈现了极显著相关性（p＜0.01），结合主成分和逐步判别分析结果，表明这5种元素都适宜成为普洱茶产地溯源模型的特征元素，说明了土壤中矿质元素对普洱茶中矿质元素含量的影响，土壤都是茶叶中微量元素的主要来源，采用微量元素作为构建普洱茶产地溯源技术的基础是可行的。

表8 三大产区普洱茶与土壤中微量元素含量相关分析Table 8 Pearson correlation coefficients between teas and soil samples from three regions

注：*表示元素含量在样品间极显著相关（p＜0.05）；**表示元素含量在样品间极显著相关（p＜0.01）。

3 结论

3.1 植物体内的矿物元素与地域土壤中的矿物元素组成密切相关[15]。土壤中的矿物元素组成受土壤类型、成土母质、土壤pH值、气候以及降水等条件的影响，在不同地域间形成其特定的元素指纹特征。这种特征差异通过“土壤-植物”系统进入到植物体内，从而造成植物组织中的微量元素的组成差异。但不是所有微量元素都是适宜元素。

3.2 通过对普洱茶三大产区生熟茶中微量元素和稀土元素含量数据进行差异分析，普洱茶中矿物元素含量在小范围地域间存在差异。在运用Fisher函数、交叉检验的基础上，采取逐步判别法进行判别分析，达到了在小范围地域内准确溯源的目的，其初始正确判别率达到94.6%，交叉检验正确识别率为71.4%，说明可以通过普洱茶中的矿质元素含量差异对不同产地的普洱茶溯源。

3.3 通过对普洱茶中矿物元素含量的方差分析、主成分分析和逐步判别判别分析，得到 La、Ce、Pr、Sm和Se 5种元素作为普洱茶溯源的表征指标候选元素，结合普洱茶产地土壤的相关性分析结果，确定5种元素可以作为溯源指标，其初始正确判别率达到94.6%，交叉检验正确识别率为89.3%。