卡琪花蒂玛中黄酮类物质的组成及抗氧化活性

席红如，吴晖，赖富饶，马娟娟，刘袆帆，陈文博

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

卡琪花蒂玛（Kacip Fatimah）是一种生长在东南亚热带雨林中的常见红色草药，它的植物学名为Labisia pumila，是紫金牛科灌木状簇生植物。纯正的卡琪花蒂玛仅生长于马来西亚海拔350 m高的无污染热带雨林中[1]。

马来西亚历代的女人们都用它的叶子煮水喝，青年少女用它来调节月经不规律，月经疼痛；孕妇用它来促进生产；产妇用它来缩宫，恢复产后体力，治疗产后骨质疏松；更年期妇女用它来缓解雌激素缺乏带来的相关疾病（心血管疾病，骨质疏松症等）；还可用它来进行美容养颜、提升性欲等等[2]。

目前，卡琪花蒂玛中已经报道的活性成分包括黄酮类、多酚类、皂苷类和有机酸类等[3]。黄酮类化合物是卡琪花蒂玛中一种重要的次级代谢产物。黄酮类物质具有较强的清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射以及保护心血管系统等生物活性功能[4]。因此研究卡琪花蒂玛中黄酮类化合物，对卡琪花蒂玛中的黄酮的有效开发利用具有重要的意义。

周洁等[5]人的研究结果表明儿茶素通过抗氧化抑制相关酶活性及抑制信号传导等来抑制肿瘤细胞入侵、细胞增殖、细胞血管再生及转移，并诱导细胞凋亡。曾亮[6]等人的研究结果表明儿茶素会抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的对数生长期，增加细菌细胞膜的通透性，造成细菌胞内蛋白质和糖类物质的渗漏，使细菌代谢发生紊乱，进而达到抑菌效果。甘宁[7]等人通过动物实验研究，结果表明杨梅素通过降低ROS水平恢复内源性 BMMSCs的成骨能力，减少卵巢大鼠骨量丢失。卞杰[8]等人的研究表明杨梅素通过激活Caspase家族蛋白实现对肝癌细胞HepG2细胞株的增殖抑制及诱导凋亡作用。

本实验分别测定了卡琪花蒂玛茎和叶中黄酮的含量及各种黄酮类化合物的组成成分，并对卡琪花蒂玛茎和叶中的黄酮的自由基清除能力做了对比分析。

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

卡琪花蒂玛的茎和叶片，产自马来西亚，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，置于阴凉干燥处待用。

1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，阿拉丁公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（ABTS），申工公司；L-抗坏血酸（Vc），亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、过硫酸钾（K2S2O8）、二水磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）、十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）、铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）、三氯乙酸、三氯化铁（FeCl3）等均为市售分析纯。标准品：大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黄豆黄苷、葛根素、槲皮素、柚皮苷、杨梅素、儿茶素、芦丁、芹菜素、山奈酚、白杨素、木犀草素、表儿茶素，阿拉丁公司。

1.2 仪器及设备

Spectrumlab 752S紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；6CE-60F-717P型高效液相色谱仪，美国Waters公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HHS-4数显恒温水浴锅，上海横平仪器仪表厂；RE-52旋转蒸发器，上海亚荣系列化仪器厂；DLSB-5L/25型低温冷却液循环泵，巩义市予华仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黄酮含量标准工作曲线的绘制

准确称取20 mg芦丁标准品，用蒸馏水溶解完全后定容至100 mL容量瓶中，得到0.2 mg/mL芦丁标准溶液；称取5 g亚硝酸钠于烧杯中，用蒸馏水溶解完全后定容到 100 mL容量瓶中得到 5%亚硝酸钠溶液；称取10 mg硝酸铝于烧杯中，用蒸馏水溶解完全后定容到100 mL容量瓶中得到10%硝酸铝溶液；称取4 g氢氧化钠于烧杯中，用蒸馏水溶解完全后定容到100 mL容量瓶中得到4%氢氧化钠溶液。

用移液枪准确移取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5 mL 0.1 mg/mL 的芦丁标准溶液于15 mL具塞试管中，然后再分别加入5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1、0 mL蒸馏水，得到浓度分别为0、20、40、60、80、100、120、160、200 mg/mL的芦丁溶液；再向每个具塞试管中分别加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀后反应6 min；然后再加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，混匀后反应6 min；最后在加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，混匀，避光反应15 min后在510 nm处测吸光值（每个梯度做3个平行）。

1.3.2 卡琪花蒂玛中黄酮含量的测定

称取一定量的已过 40目筛的卡琪花蒂玛茎和叶片的粉末，在一定的温度、乙醇浓度、料液比条件下提取一定时间，离心，过滤，定容[9]。移取一定量待测液按 1.2.1方法测定吸光度，按下式计算黄酮提取率：黄酮提取率(mg/gFW)=(C×V×n)/m

式中，C代表根据回归方程计算得到的质量浓度（mg/mL），V代表提取液总体积（mL），n代表稀释倍数，m代表卡琪花蒂玛叶片粉末质量（g）。

1.3.3 HPLC法测定黄酮类化合物含量

参考文献[3,10]的方法，但对洗脱程序，进样量和流速条件稍作修改。A：0.1%甲酸；B：乙腈。洗脱程序：0～5 min：10%B；5～45 min 10%～90%B；45～50 min 90%B；50～55 min 90%～10%B；55～60 min 10%B；流速为0.6 mL/min，进样量为20 μL。将10种黄酮和6种异黄酮类化合物的标准品配置成一定浓度的溶液，按上述色谱条件测定并制作标准曲线，采用外标法进行定量。每种黄酮类化合物的含量用μg/mL表示。

1.3.4 DPPH自由基清除能力测定

DPPH实验方法参照文献[11]方法进行改进。用乙醇配制浓度为0.2 mmol/L的DPPH工作液，避光放置一个晚上待用。向1 mL不同浓度的样品溶液中加入3 mL DPPH 工作液，暗处反应 30 min 后在 517 nm 处测定吸光值。以Vc作为阳性对照，清除DPPH自由基能力按下式计算：

DPPH自由基清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中，A0为1 mL 无水乙醇+3 mL DPPH 乙醇溶液的吸光度；A1为1 mL样品溶液+3 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2为1 mL样品溶液+3 mL乙醇溶液的吸光度。

1.3.5 ABTS自由基清除能力测定

ABTS实验方法参照文献[12]进行改进。首先分别配制浓度为 7.4 mmol/L的 ABTS溶液和浓度为 2.6 mmol/L的高硫酸钾溶液，然后将二者按1:1混合，室温下避光过夜。使用时用无水乙醇将ABTS工作液稀释40～50倍左右，使其吸光值A734=0.7±0.02。然后向0.2 mL不同浓度的样品溶液中加入 2 mL稀释过的ABTS工作液，暗处反应30 min后在734 nm处测定吸光值。

1.3.6 Fe3+还原力测定

Fe3+还原实验方法按照参考文献[13]。

1.3.7 数据统计分析

所有试验均做 3组平行，结果以平均值±标准方差（mean±SD）表示。采用SPSS 17.0统计软件的单因素方差分析（one-way ANOVA）和 Duncan's multiple range test方法进行数据统计(p＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 黄酮含量标准工作曲线

图1 芦丁标准工作曲线 Fig.1 Standard curve of Rutin

芦丁的标准曲线回归方程为Y=0.0084X-0.0709，其中Y为吸光度，X为芦丁浓度μg/mL；R2=0.9922，表明在 20～200 μg/mL的浓度范围内与吸光度具有良好的线性关系，可用于测定黄酮含量。根据最优提取方法分别提取卡琪花蒂玛茎和叶中的黄酮，并测得卡琪花蒂玛的茎和叶中黄酮含量分别为 27.52±4.21、35.43±14.16 mgRutin/gFW，即每克卡琪花蒂玛茎和叶的粉末中黄酮的含量分别为 27.52±4.21、35.43±14.16 mg。

2.2 卡琪花蒂玛中黄酮的含量

由表1可知，大豆苷和黄豆黄苷；木犀草素和槲皮素；芹菜素和染料木苷三组的出峰时间较为接近，其他 10种黄酮标准品在该条件下均可以得到较好的分离。

表2 茎和叶中黄酮的HPLC分析Table 2 HPLC analysis of Stem and Leaf

由表 2可知，茎中含有染料木苷（2.44±0.012 mg/gFW）、柚皮苷（2.45±0.027 mg/gFW）、和杨梅素（10.16±2.443 mg/gFW）；叶子中含有儿茶素（9.18±1.182 mg/gFW）、黄豆黄苷（2.55±0.031 mg/gFW）、芦丁（2.92±0.022 mg/gFW）、柚皮苷（2.50±0.017 mg/gFW ） 和 杨 梅 素 （ 10.18±2.347 mg/gFW）。其中茎中杨梅素的含量较高，叶子中含有的儿茶素和杨梅素含量较高；并且叶子中杨梅素的含量和茎中杨梅素的含量相近。茎中染料木苷和叶中的黄豆黄苷均是异黄酮，是植物雌激素，有雌二醇具有类似的功能，推测可能与卡琪花蒂玛可以治疗产后骨质疏松，恢复产后体力等功能密切相关；而其他种类的黄酮如杨梅素，儿茶素等可能与卡琪花蒂玛具有很好的抗氧化活性密切相关。

2.3 DPPH自由基清除能力

图2 DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity

卡琪花蒂玛中黄酮类物质和Vc对DPPH清除能力见图2。由图2可知，DPPH自由基的清除能力与黄酮和Vc的浓度密切相关。随着黄酮浓度的升高，对DPPH自由基的清除能力也增强。当叶子中黄酮浓度在3 μg/mL时，它对DPPH自由基的清除能力就达到最大；当茎中黄酮浓度在6 μg/mL时它对DPPH自由基的清除能力达到最大；叶子中黄酮对DPPH自由基清除能力的IC50为0.99 μg/mL，茎中黄酮对DPPH自由基清除能力的IC50为1.91 μg/mL；从图中还可以看出当黄酮浓度在1.5～6 μg/mL时，对DPPH自由基的清除能力随着浓度的升高明显增高，在 0.375～0.75 μg/mL和6～12 μg/mL时，随浓度升高清除能力未出现明显升高，分析可能是黄酮浓度过低时，不能够与过量自由基中和，所以DPPH本身的颜色掩盖了被中和的DPPH的颜色，因此不会呈现出明显的剂量依赖性；而当黄酮浓度过高时，DPPH自由基几乎完全被中和，所以也不会呈现出剂量依赖性。并且由图可以看出卡琪花蒂玛中茎和叶对 DPPH自由基的清除能力是Cleaf＞Cstem。

2.4 ABTS自由基清除能力

卡琪花蒂玛中黄酮类物质和Vc对ABTS清除能力见图3。由图3可知，ABTS自由基的清除能力与黄酮的浓度密切相关。当黄酮浓度在6 μg/mL时，它对ABTS自由基的清除能力就达到最大；叶子中黄酮对ABTS自由基清除能力的IC50为2.26 μg/mL，茎中黄酮对ABTS自由基清除能力的IC50为3.60 μg/mL；并且由图可以看出在浓度范围为0.375至6 μg/mL时，对ABTS的清除能力Cleaf＞Cstem＞Vc。当黄酮浓度过低，也即是抗氧化剂含量过低时，不能够组织ABTS被氧化成绿色的 ABTS·+，当黄酮浓度适量时，随着黄酮浓度的升高，被氧化的 ABTS·+自由基的量就会下降，当黄酮浓度过高时，就会阻止所有的ABTS被氧化，所以清除率就不会再随着黄酮浓度升高而增大。

图3 ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS radical scavenging activity

2.5 Fe3+还原能力

图4 Fe3+还原能力Fig.4 Fe3+ Reducing power

卡琪花蒂玛中黄酮类物质和Vc对Fe3+还原能力见图4。由图4可知，Fe3+还原能力与黄酮和Vc的浓度密切相关。当叶子中黄酮浓度在12 μg/mL时，它对Fe3+还原能力就达到最大；当茎中黄酮浓度在 12 μg/mL时它对Fe3+还原能力达到最大；并且由图可以看出在浓度范围为0.375至12 μg/mL时，对Fe3+还原能力Cleaf＞Cstem＞Vc。并且在1.5至12 μg/mL 时，黄酮对Fe3+的还原能力呈显著相关性。

3 结论

3.1 卡琪花蒂玛茎和叶子中的总黄酮含量分别为27.52±4.21、35.43±14.16 mgRutin/gFW。其中，茎中含有染料木苷（2.44±0.012 mg/gFW）、柚皮苷（2.45±0.027 mg/gFW）、和杨梅素（10.16±2.443 mg/gFW）；叶子中含有儿茶素（9.18±1.182 mg/gFW）、黄豆黄苷（2.55±0.031 mg/gFW）、芦丁（2.92±0.022 mg/gFW）、柚皮苷（2.50±0.017 mg/gFW）和杨梅素（10.16±2.347 mg/gFW）。

3.2 茎和叶中的黄酮的抗氧化能力在不同的抗氧化体系中均有显著效果：其中茎中黄酮对DPPH、ABTS自由基清除能力的 IC50值分别为 1.91、3.60 μgRutin/mL，叶子中黄酮对 DPPH、ABTS自由基清除能力相对较好，IC50值分别为 0.99、2.26 μgRutin/mL。

3.3 根据实验结果可知卡琪花蒂玛茎中黄酮含量约占2.8%，叶中黄酮含量约占3.5%，均高于葛根[14]中1.2%黄酮和具有类似功能的益母草[15]中0.28%黄酮；并且卡琪花蒂玛叶中黄酮含量高于茎中黄酮含量。卡琪花蒂玛中含量相对较多的黄酮-儿茶素和杨梅素具有很好抗氧化、抗癌[5]和减少骨质疏松[7]的作用与本实验结果中卡琪花蒂玛具有很好抗氧化活性相呼应，为进一步开发利用卡琪花蒂玛中黄酮提供了理论基础。