冻藏时间对冷冻面团馒头品质的影响

黄桂东，黄伟志，冯结铧，唐素婷，吴子蓥，钟先锋

（佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东省传统发酵食品工程技术研究中心，广东省食品流通安全控制工程技术研究中心，佛山市酿造工程技术研究中心，佛山农业生物制造工程技术研究中心，广东佛山 528200）

冷冻面团技术应用在馒头上，不仅能延长馒头耐藏性能，而且较大程度的保持馒头的原有风味、营养， 使得冷冻面团馒头产业得到迅速发展。虽然低温储存方式延长了馒头的货架期，但对馒头品质也产生了一定负面作用[1,2]。Meziani等[3]研究证实冻藏过程中会造成酵母活菌数减少，导致馒头品质下降；也有相关报道指出冻藏过程中会给面团品质带来伤害，例如酵母活力降低、面筋结构强度弱化和产品感官特性变差等[3,4]。从宏观角度上呈现出冻藏后馒头醒发时间延长、比容变小等问题[5,6]。

据研究发现，在冻藏过程中，由自由水形成的冰晶及重结晶会较大程度地伤害酵母细胞，致使酵母细胞受到不可复原的机械损伤，酵母活性下降，甚至导致酵母细胞死亡；同时冰晶也会破坏面筋网络结构，使面团的结构牢固性和持气功能减弱，导致馒头品质下降[7,8]。因此冰晶是造成冷冻面团品质下降的主要原因，目前国内外尚无法较好地解决冷冻面团在冻藏过程中因冰晶导致的品质下降问题。鉴此，为了解决冷冻面团馒头品质问题，探究其品质劣变机理，石媛媛等[9]应用质构仪和核磁共振等技术，表明了冻藏时间的延长，冷冻面团的发酵力下降、馒头的比容和质构特性呈现下降趋势，冷冻面团失水率明显升高，驰豫时间也随冻藏时间的延长逐渐变大。姬成宇等[10]也通过傅里叶变换红外光谱技术以及核磁共振技术等技术表明，随着冻藏时间的延长，蛋白二级结构中分子间β-折叠含量增大，β-转角含量减小，而冻融循环使得α-螺旋结构含量下降。

因此本文采用酵母菌活性测定、质构特性测定、傅里叶变换红外光谱测定面筋蛋白二级结构、扫描电镜观察面团微观结构等方法进一步探讨冻藏时间对冷冻面团馒头品质的影响，从宏观和微观角度，全面客观地分析冷冻面团馒头品质变化，为后续提高冷冻面团馒头品质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金龙鱼多用途麦芯粉，益海嘉里食品营销有限公司；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；白砂糖，佛山市昌大昌超级购物广场有限公司；光谱纯KBr，天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化钠、蛋白胨、葡萄糖、硫酸二氢钾、琼脂粉、硫酸镁、孟加拉红、氯霉素，广州创天生物科技有限公司；蒸馏水、自来水。

1.2 仪器与设备

HMJ-01和面机，中山市雅乐思电器实业有限公司；LRHS-300F-II恒温恒湿培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；DHG-9248A鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；GR60DA全自动灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；宁波新芝Seients-30N冷冻干燥机，广州倍立思仪器有限公司；TENSOR 27傅里叶变换红外光谱仪，布鲁克（北京）科技有限公司；日立高新S-4800扫描电子显微镜，日本Hitachi公司；DW-40L188低温冰箱，上海领德仪器有限公司；Thermo超低温冰箱（-80 ℃），济南博鑫生物技术有限公司；TXB622L电子精密天平，上海冠唯仪器有限公司；DF-4型红外压片机，天津港东科技发展股份有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，广州市深华生物技术有限公司；DHP-9162型培养箱，上海晟析实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 冷冻面团馒头的制作工艺要点

面团的基本配方（以面粉100%计算）：面粉100%，高活性干酵母1%，自来水50%，白砂糖10%。

根据参考文献[11]方法进行操作并加以适当调整，其中在制作冷冻面团时的具体制作流程为：原辅料混合→和面→分切（称重）→成型→速冻（-40 ℃，30 min）→冷藏（-20 ℃）。

将上述制得的冷冻面团分别冻藏 1周、2周、3周、4周、5周备用。

1.3.2 冷冻面团中酵母菌的测定

根据文献[12]方法和结合实际情况进行改进测定面团酵母菌数。测定新鲜面团酵母菌数（以每克面团计算）：首先将新鲜面团用干净剪刀或者刀从面团表面、内芯共2不同部位剪切下5 g，置于45 mL无菌生理盐水中摇动3 min左右以提取酵母菌；测定冷冻面团酵母菌数（以每克面团计算）：将冻藏的冷冻面团先在4 ℃低温冰箱解冻至面团软化后从表面、内芯等不同部位剪切下5 g，置于45 mL无菌生理盐水中摇动3 min左右以提取酵母菌。

用1 mL移液器吸取震荡后上清液，以105倍数稀释混匀后，吸取1 mL稀释液加入到孟加拉红琼脂培养基中，进行涂布，涂布结束将培养皿倒置移放在37 ℃培养箱中，培养48 h后取出进行平板菌落计数。表面面团、内芯面团各计数两个平板，重复实验3次，结果取平均值，冷冻后酵母菌存活率的计算公式为：

式中：P-冷冻后酵母菌的存活率，%；A：冷冻面团酵母菌落数（以每克面团计算），lg CFU/g；A0：新鲜面团酵母菌落数（以每克面团计算），lg CFU/g。

1.3.3 冷冻面团馒头的质构测定

表1 质构仪程序参数Table 1 The Program Parameters of the Texture Instrument

根据文献[13]方法，结合实际操作，将蒸制好的馒头冷却30 min后，使用TA.new plus物性测定仪进行质构测试，选取3个样品重复试验，每个样品重复测3次，结果取均值。程序参数设定条件如表1。

1.4 冷冻面团面筋蛋白二级结构的测定 1.4.1 面筋蛋白的提取

在马丁法[14]基础上，稍作改进。如下：将冷藏相应天数的冷冻面团放置于 4 ℃冰箱中解冻至面团软化，备用；将解冻后的面团放在2% NaCl溶液中静置15～20 min，接着对面团进行反复轻轻揉洗，尽可能确保面团完整性，一直揉洗至 NaCl溶液无混浊、无乳白色及面筋上无白色面粉颗粒，揉洗结束后将面筋蛋白至于40 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥，24 h。将干燥后面筋蛋白用研钵进行粉碎研磨，过100目筛，即得面筋蛋白，备用，同时将KBr用研钵研磨成粉末后，备用。

1.4.2 面筋蛋白的FT-IR测定

样品混合前，先使用红外干燥机对面筋蛋白及KBr干燥 20～30 min。干燥后，用精密天平称量 2.0 mg面筋蛋白样品及0.2～0.4 g KBr，混合，用玛瑙研钵研磨均匀后，用红外配套压片机进行压片，使压片压力保持在 15～20 kPa，1 min 后将样品进行 FT-IR 扫描。背景采集使用 KBr固体作为空白，扫描范围为400～4000 cm-1，扫描次数为32次，分辨率为4[15]。

1.4.3 面筋蛋白FT-IR图谱测定

实验图谱采用Omnic 8.2软件及Perkfit 4.2软件进行分析，对1600～1700 cm-1（酰胺Ⅰ带）进行去卷积、平滑处理，求其二级导数获得特征峰进行曲线拟合，拟合后得到特征峰峰面积，即可计算面筋蛋白二级结构含量[16,17]。酰胺Ⅰ带特征峰与面筋蛋白二级结构对应关系为（表2）：

表2 酰胺Ⅰ带特征频率和峰的归属Table 2 Wavenumber and Band Assignment in Amide Ⅰ Region

1.5 冷冻面团微观结构的观察

根据文献[18]方法并结合实际条件，使用扫描电子显微镜观察、记录冻藏不同时间的冷冻面团微观结构。将冻藏后样品切成1 cm2大小的正方形进行冷冻干燥，冷冻干燥结束后用导电双面胶固定到样品台上进行样品表面喷金，喷金后置于SEM下观察（电压10 kV）。

1.6 数据处理方法

数据采用 WPS Excel 2013 统计分析、SPSS 19.0、Omnic 8.2、Peakfit 4.2 软件分析及 Origin 9.0 作图。

2 结果与分析

2.1 冻藏时间对冷冻面团中酵母菌的影响

由图1、2可知，随着冻藏时间延长，酵母菌数量及存活率呈递减趋势。实验结果与陈迪等[19]研究冷藏时间延长与冷冻酸面团中乳酸菌活力显著下降结论相一致。在新鲜面团中，表面酵母菌数量为 11.9 lg CFU/g，内芯酵母菌数量为11.7 lg CFU/g；冻藏1周后，面团表面中酵母菌数量为6.1 lg CFU/g，内芯酵母菌数量为5.9 lg CFU/g；由以上数据可知，酵母菌经过冻藏后数量减少50%左右，这也客观、真实地验证了冻藏会对酵母菌造成损伤的这个理论。同时从图1、2中还可得出，冷冻面团中表面酵母菌数量及存活率要比内芯酵母菌数量及存活率要多。

图1 不同冻藏时间对新鲜、冷冻面团酵母菌数的影响Table 1 Effects of Different Refrigeration Time on the Number of Yeast in Fresh and Frozen Dough

图2 不同冻藏时间对冷冻面团酵母菌存活率的影响Table 2 Effect of Different Refrigerated Time on the Survival Rate of Yeast in Frozen Dough

这可能是在冻藏过程中面团中可冻结水分发生迁移，面团表面水分含量比内芯水分要少，因此表面形成冰晶较内芯少，从而冰晶对面团表面酵母菌伤害力相对较少，表面酵母菌数量比内芯酵母菌数量高[20]。

2.2 冻藏时间对冷冻面团馒头中质构的影响

图3 不同冻藏时间对冷冻面团馒头质构的影响Fig.3 Effect of Different Refrigerated Time on Texture of Frozen Dough Steamed Bread

从图3中可以看出，冷冻面团馒头冻藏1周后，硬度、咀嚼性、胶着性分别为 2014 gf、1826.8 gf、1903.58 gf。

冻藏5周后硬度、咀嚼性、胶着性分别为3520 gf、3209.96 gf、3332.36 gf。由此可知，经过 5 周冻藏，冷冻面团馒头的硬度、咀嚼性、胶着性分别增大74.6%、75.7%、75.6%，这说明了冻藏时间对冷冻面团馒头品质是有影响的。根据相关研究表明，在冻藏期间，温度的波动及水分迁移会造成冰晶重结晶，重结晶成大冰晶能使酵母细胞和面筋网络受到机械损伤，一方面导致醒发阶段酵母由于存活率低，产气能力下降，蒸制后馒头硬度变大；另一方面长时间冻藏对面筋网络也造成不可逆的破坏，不能较好地支撑整个面团，使面团变得扁平、下塌，致使馒头品质下降[21]。

2.3 冻藏时间对冷冻面团中面筋蛋白二级结构的影响

图4 不同冻藏时间的冷冻面团面筋蛋白酰胺Ⅰ带去卷积示意图Fig.4 Schematic Diagram of Deconvolution of Frozen Dough Gluten Protein Bands at Different Refrigerating Time

由表3可知，冷冻面团峰属都位于3300 cm-1左右，与3401 cm-1（蛋白质或氨基酸中N-H键的伸缩振动区，当N-H键与O-H缔合后，将向低波数位移）相比较，冷冻面团特征峰均向低波数位移，说明冷冻面团中有N-H键与氢键缔合。同时从表中可看出，冷冻面团在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中均有特征峰属，表明冷冻面团含有淀粉、蛋白质特性[22]，其中在酰胺Ⅰ中，冷冻面团的特征峰发生了较为明显地偏移，说明冻藏时间的延长可能造成了面筋蛋白结构改变[23]。在990～1450 cm-1波段中，只有 1024 cm-1处发生明显偏移，说明冻藏时间的延长会使冷冻面团中的氢键（淀粉与面筋结构蛋白分子之间的缔结键）发生改变，这可能是由于冻藏时间的延长，冰晶的形成及冰晶重结晶影响了淀粉与面筋蛋白的结合，特征基团含量发生改变，最终导致特征峰吸收强度的改变[23～26]。

表3 FT-IR特征峰以及样品吸收波数Table 3 FT-IR Characteristic Peaks and Absorption Wavenumbers of Dough with Different Amounts of Added Water

由图4、表1峰归属分析可知，冷冻面团峰位置波数集中在1618±3（β-折叠）、1637±3（β-折叠）、1653±3（α-螺旋）、1663±4（β-转角）、1683±2（β-转角）这 5个区域内，且只有在这5个区域有其特征谱带，说明冷冻面团只包含α-螺旋、β-折叠及β-转角这3种结构，不存在无规卷曲结构。从表4中可知，随着冻藏时间增加，冷冻面团面筋蛋白中α-螺旋都呈下降趋势，β-转角和β-折叠比例则呈上升趋势。这与宋国胜等[28]研究得出的冻藏面筋蛋白α-螺旋结构含量呈下降趋势结论相一致。这可能是在冻藏过程，冰晶的形成及长大破坏面筋结构中的氢键，降低面筋结构致密性，蛋白分子发生构象重排，从而导致α-螺旋结构含量减少。

表4 冻藏期间面筋蛋白二级结构的变化Table 4 Changes in the secondary Structure of the Gluten Protein during Refrigerated Time

2.4 冻藏时间对冷冻面团微观结构的影响

图5 不同冻藏时间对冷冻面团微观结构的影响Fig.5 Effect of Different Refrigeration Time on the Microstructure of Frozen Dough

图5为冷冻面团样品的扫描电镜结果，从图中可以清楚的看出，图中圆球状的是淀粉颗粒，淀粉颗粒被面筋蛋白包裹在网络结构内；黑色孔洞可能是冰晶在冷冻干燥过程中升华留下的空间或者面团发酵产生CO2形成的气孔所致。由图a、c、e、g、i和b、d、f、h、j可知，随着冻藏时间的增加，面筋蛋白网络结构逐步减少，淀粉颗粒与面筋结构分离出来，部分淀粉颗粒完全裸露在外面，尤其在冻藏5周后与第1周对比可知，冻藏时间的延长会造成面筋蛋白网络结构破坏，面筋结构表面变的粗糙而且松散，导致更多的淀粉颗粒向外裸露出来，这结果也与王金水、Baier-Schenk等[33,34]的研究结论相一致。柳小军[35]认为在冻藏延长过程中，冷冻面团中的冰晶不断长大，破坏了面筋蛋白网络结构，同时冻藏温度的波动也会使一部分冰晶解冻成水分，并发生迁移至新的位置重新结晶，进一步加剧了对面筋蛋白结构的破坏。

3 结论

本文从宏观和微观角度，探讨了冻藏时间对冷冻面团馒头品质变化的影响。结果表明，随着冻藏时间的延长，冷冻面团中的酵母菌数量及存活率呈递减趋势，其中冻藏1周后，表面和内芯的酵母菌数量均减少5.8 lg CFU/g；经过5周冻藏后，冷冻面团馒头的硬度、咀嚼性、胶着性分别增大74.6%、75.7%、75.6%；面筋蛋白二级结构中α-螺旋也随着冻藏时间的延长呈下降趋势，蛋白二级结构稳定性逐渐下降；经过扫描电镜观察发现，面筋网络结构逐步减少，淀粉颗粒与面筋结构分离，部分淀粉颗粒完全裸露，说明过长的冻藏时间对冷冻面团馒头品质不利。本研究结果为后续研究改善冷冻面团馒头品质提供了理论依据。