山羊BMP15基因生物信息学分析

胡 姗，方 乾，李 浩，朱海鲸，胡建宏*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨陵 712100；2.榆林学院 陕西省绒山羊工程技术研究中心，陕西 榆林719000 )

骨形态发生蛋白15(BMP15)与GDF9互为同系物，也称为GDF9B，属于BMPs大亚群，是TGFβ超家族中成员。BMP15 cDNA全长约为1 180 bp，编码的前体蛋白有400个氨基酸左右[1-2]。人和绵羊的BMP15成熟肽由125 个氨基酸残基组成，含有 6个保守的Cys残基，缺乏第4个Cys残基。BMP15可以与 GDF9以非共价键连接成异源二聚体来发挥生物学活性。

BMP15在卵母细胞中可以大量表达，可以调节卵泡发育、颗粒细胞增殖、和卵丘分化等，对雌性动物的繁殖力有至关重要的调控作用[3-5]。研究发现，BMP15在卵泡发育中的作用有物种差异性，如在小鼠卵巢中，BMP15基因突变为杂合和纯合时，与野生型相比，可发育成胚胎的卵泡占所有卵泡的比重分别降低了约30%和43%，部分卵泡可以发育[6]。而绵羊BMP15基因突变为纯合体时卵泡发育停滞[7]。

有研究发现在一些物种的垂体、下丘脑、睾丸及其他组织中发现有BMP15表达[8-10]，这说明BMP15也可能参与调节其他组织的发育。Otsuka等[8,11]研究发现，BMP15在小鼠垂体中表达，其可以调节下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌通路，促进垂体分泌合成FSH，进而促进卵泡的发育。目前，除了卵巢和垂体外，关于BMP15在其他组织中的功能作用研究鲜见报道。鉴于BMP15的重要作用，本研究通过运用生物信息学方法，应用BioXM、DNAMAN、SignalP、ProtScale、PredicProtein等生物软件或在线程序分析山羊BMP15基因cDNA序列信息，预测其编码的蛋白的理化性质、二级结构、疏水性、信号肽、功能结构域和功能，为进一步研究对BMP15蛋白的功能调节机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 数据来源

利用NCBI数据库获得各物种的BMP15基因cDNA序列及其编码的蛋白序列。各物种BMP15 GenBank 登录号分别为：山羊NM_001285588.1、绵羊NM_001114767.1、小鼠NM_009757.5、大鼠NM_021670.1、猪NM_001005155.2、人 NM_005448.2、牛NM_001031752.1、斑马鱼NM_001020484.1、鸡NM_001006589.2。

1.2 生物信息学分析

应用DNAMAN软件对不同物种BMP15基因和蛋白序列进行同源性比对，分析BMP15基因和蛋白在山羊与其他物种间的进化关系。利用ProtParm在线程序(http://web. expasy. org/cgi-bin/protparam/protparam)和BioXM软件对山羊BMP15蛋白序列进行理化参数分析，包括分子质量、氨基酸组成、脂肪系数、等电点预测等参数。利用ProtScale在线程序(http://web.expasy.org/protscale/)对山羊BMP15蛋白进行疏水性分析。利用SignalP在线程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对BMP15蛋白质进行信号肽功能分析。利用TMHMM在线程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)进行BMP15蛋白质跨膜区结构分析。利用PredicProtein(https://www.predictprotein.org/home)和PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ secpred_hnn.pl)在线程序对BMP15蛋白二级结构进行预测分析。利用prosite和Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线程序(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)对蛋白功能结构域进行预测分析。利用ProtFun(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)在线程序进行蛋白功能预测。

2 结果与分析

2.1 山羊BMP15基因序列分析

对从NCBI数据库中获得的山羊BMP15基因cDNA序列进行统计分析，可知BMP15基因包含一个长1 185 bp完整的ORF。山羊BMP15基因四种碱基A、T、C、G数目分别为23.4%、24. 5%、27.6%和24.5% ，AT和GC 含量相对平衡。

2.2 山羊BMP15蛋白序列分析

山羊BMP15基因共编码蛋白394个氨基酸(表1)，脯氨酸含量最高，达到18.6%，亮氨酸次之，达到12.9%。ASP和Glu总数量为30，二者携带正电荷；Arg和Lys总数量为43，二者携带负电荷。其蛋白分子式为C2080H3180N578O552S16，理论等电点为9.44，消光系数在280 nm时为69 370，不稳定系数稍高为47.24，大于40，说明BMP15是一个不稳定蛋白。总平均亲水性为-0.342，脂肪系数即疏水值为91.75，说明该蛋白为亲水性蛋白。

2.3 物种间同源性分析

不同物种间BMP15 cDNA序列比对发现，山羊与绵羊、牛、猪、人、鸡和斑马鱼同源性分别为92%、98%、91%、83%、78%、54%和47%。不同物种间BMP15编码的蛋白序列比对发现，山羊与绵羊、牛、猪、人、鸡和斑马鱼同源性分别为99%、98%、90%、77%、71%、45%和32%(图1)。山羊与绵羊、牛、人和猪BMP15基因序列及其编码的蛋白之间同源性较高，山羊与鸡和斑马鱼BMP15基因同源性与BMP15编码的蛋白同源性相比相差稍大。

表1 山羊BMP15基因编码的氨基酸组成Table 1 The compositions of Amino acids encoded by goat BMP15 gene

2.4 BMP15编码的蛋白疏水性分析

利用ProtScale在线网站程序分析BMP15蛋白疏水性质，发现BMP15多肽链表现出较强的亲水性(图2)，ProtParm在线网站程序预测的理化参数总平均亲水性为-0.342，二者得出相同的推论，即BMP15蛋白是一种可溶性蛋白。在BMP15多肽链第13位甘氨酸具有最高的分值2.933，第57位精氨酸具有最低的分值-3.044。

2.5 BMP15蛋白信号肽分析

利用SignalP在线网站程序分析BMP15蛋白，得到C、Y、S和D值分别为0.614、0.732、0.991和0.815(图3)，在25和26位氨基酸之间有剪切位点的可能性较大，可以得出推论BMP15蛋白存在信号肽，且是个分泌型蛋白。另外，S-mean 值为1-24，推测信号肽长度为24。

2.6 BMP15蛋白的磷酸化修饰位点和跨膜区预测

利用KinasePhos在线网络平台程序对BMP15蛋白的磷酸化修饰位点进行预测发现无磷酸化修饰位点。利用TMHMM在线网络平台程序对BMP15蛋白的跨膜区分析，预测发现其无跨膜区(图4)。

2.7 BMP15蛋白二级结构预测

利用COILS进行BMP15蛋白卷曲螺旋预测，得到以14窗口显示在55～60位氨基酸存在卷曲螺旋(图5)。利用PredicProtein和PRABI预测出山羊BMP15蛋白中含有α-螺旋133个，占33.76%；无规卷曲有209个，占53.05%(图6)，该蛋白二级结构以无规卷曲为主。

2.8 BMP15的功能域预测

利用Smart在线网站程序对BMP15蛋白功能结构域进行预测分析，表明BMP15有TGFβ功能结构域，位于293～394氨基酸区域(图7 B)。利用Prosite在线网站程序预测得到1条序列谱(TGFβ-2)和1条模式(TGFβ-1)与BMP15匹配(图7 A)，二者均属于TGFβ超家族。TGFβ-2 和TGFβ-1编码蛋白的活性区域分别位于266～394和311～326，二者对细胞增殖分化调控有重要的作用。利用ProtFun在线网站程序对BMP15蛋白功能预测，得到山羊BMP15具有细胞外被膜、中间代谢、转运结合和生物合成辅助因子功能的可能性分别为12.822、3.785、1.549和1.531(表2)，其中细胞外被膜功能的可能性最大，推测其合成后可能被转运到细胞外膜上进行功能反应。在基因本体范畴中，BMP15作为激素的可能性最大，为5.707。

图1 BMP15基因及其编码的蛋白同源性分析A. BMP15基因同源性分析；B. BMP15基因编码的蛋白同源性分析Fig. 1 The homology analysis of BMP15 gene and its encoding protein

图2 BMP15编码的蛋白疏水性分析Fig. 2 The analysis of hydrophobicity of the encoded protein by BMP15

图3 信号肽分析Fig. 3 Prediction of signal peptide

图4 跨膜区预测Fig. 4 Prediction of tranamembrane region

图5 COILS程序分析BMP15蛋白卷曲螺旋结构Fig. 5 The analysis of BMP15 protein coiled by COILS program

3 讨 论

用生物信息学技术来分析基因及其编码蛋白结构与功能，能为我们进一步研究基因功能做导向，奠定一定的理论基础。在本研究中，通过统计分析得到山羊BMP15基因包含一个长1 185 bp完整的ORF，编码394个氨基酸。BMP15蛋白是一个不稳定的碱性蛋白。通过疏水性分析和理化参数分析得到BMP15蛋白可能是亲水性蛋白。

不同物种间BMP15基因及其编码序列比对发现，山羊与绵羊、牛、人和猪之间同源性较高，山羊与鸡和斑马鱼同源性较低。这提示了在哺乳动物中BMP15基因进化比较保守，其蛋白功能是否存在差异还需要进一步的研究。

图6 山羊BMP15蛋白二级结构预测h.α-螺旋；e. β-折叠；c.无规则卷曲Fig. 6 The prediction of secondary structure of goat BMP15 proteinh. α-helix；e. β-sheet；c. random coil

在利用SignalP做信号肽分析时，某位点C值高，则该位点有很大可能是剪切位点，Y值最高点一般认为是最佳的剪切位点，S值低分和高分位置分别表示氨基酸位于成熟蛋白和信号肽部位，D值可以区分分泌及非分泌蛋白，分泌蛋白计算值高[12-13]。在本研究中C、Y最高值位于第26位位点，D值为0.815，因此推测BMP15蛋白存在信号肽，在25和26位氨基酸之间可能存在最佳剪切位点，且是个分泌型蛋白。徐洋洋(2015)研究发现[14]，仓鼠BMP15 蛋白在 27～28 处可能存在最佳剪切位点，与本研究最佳剪切位点有所不同，这可能是由于仓鼠和山羊BMP15蛋白序列存在差异。

激素是一种由内分泌细胞分泌，在体内作为信使传递信息，对机体的代谢、生长、发育、繁殖等生理过程起调节作用的物质。利用ProtFun在线网站程序对BMP15蛋白功能预测发现，在基因本体范畴中，山羊BMP15作为激素的可能性最大，这说明BMP15可能作为一种激素来调节机体的生长、发育等活动。刘世佳等[15]研究发现绵羊BMP15作为激素参与生物学过程的可能性最高，与本研究结果相同。另外，本研究发现BMP15有TGFβ功能结构域，同样，徐洋洋[14]和刘世佳等[15]分别研究仓鼠和绵羊BMP15蛋白序列时发现均有TGFβ功能结构域，与本研究结果相同。TGFβ在细胞增殖分化、胚胎发生、卵巢发育、睾丸发育、器官发育、免疫应答、肿瘤发生发展等方面生理过程中有重要的调控作用[16-18]，这与上述预测的基因本体范畴可能性最大的激素的功能一致，因此，推测BMP15可能作为激素参与调控细胞增殖分化、器官生长发育等生理活动。刘世佳等[15]研究绵羊BMP15在不同组织中的表达量时发现，在母羊中，BMP15在卵巢中的表达量显著高于其它组织，在公羊中，BMP15在十二指肠中的表达量显著高于其它组织，且在睾丸、肝、肾等其它组织中BMP15均有一定的表达，结合预测到的BMP15蛋白的功能，可推测山羊BMP15在十二指肠、睾丸、肝、肾等组织生理过程中也有重要的作用，这可为深入研究BMP15蛋白功能提供方向及依据。

表2 山羊BMP15功能预测Table 2 The function prediction of goat BMP15

4 结 论

山羊BMP15 基因及蛋白序列和绵羊、牛的同源性最高，亲缘关系最近。山羊BMP15蛋白可能属于分泌性蛋白，存在信号肽，具有信号转导功能。山羊BMP15蛋白可能作为激素参与调控细胞增殖分化、器官生长发育等生理活动。