不同浓度硒处理对豆瓣菜生长及硒富集的影响

李克强，陈发波，林立金，廖明安*，黄科文，李华雄，薛莞莞

（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；2.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100；3.四川农业大学果蔬研究所，成都 611130；4.四川省内江市农业科学院林果研究所，四川内江 641000）

硒是人体必需微量元素，在人体中起到抗癌、抵御多种疾病（如防止心脑血管疾病、克山病等）、延缓衰老等作用，人体补充适量硒可增强免疫力[1-2]。由于无机硒酸盐对人体毒性大[3]，要满足人体对硒元素的需求，目前常采用土壤施硒或叶面喷硒的方法，由植物将无机硒转化为有机硒，并通过粮食作物或蔬菜进入食物链以供人或动物利用[4-5]。不同植物对硒的耐受能力及吸收能力有很大差异，人们根据植物富集硒的能力差异，划分出原生硒富集植物、次生硒富集植物和非富硒植物3种类型。原生硒富集植物即硒超富集植物，当其生长在高硒土壤中，硒含量可高于 1 000 mg/kg，如豆科黄芪属（Astragalus sp.）、假含羞草属（Neptunia sp.）、十字花科鸡冠花属（Stanleya sp.）等属中的植物；次生硒富集植物硒含量可高达数百mg/kg，分布在紫苑属（Aster sp.）、滨藜属（Atriplex sp.）、草木犀属（Melilotus sp.）和云苔属（Brassica sp.）等属中[6-8]。而大部分蔬菜则属于非富硒植物，虽然能吸收并积累硒，但其富集能力有限且不能在过高硒浓度条件下生长[9-11]。因此，筛选出一种生长迅速、对硒富集量大且耐受性强的硒富集蔬菜很有必要。

豆瓣菜（Nasturtium officinale）又叫西洋菜，属十字花科豆瓣菜属，为一、二年生水生草本植物，原产欧洲地中海东部，约二十世纪初引至我国栽种[12]。国内豆瓣菜属于豆瓣菜属的共有2种植物，即豆瓣菜以及西藏豆瓣菜，这2个种在全国大部分地区为野生状态，沿海地区常用作绿叶水生蔬菜栽培[13]。已有研究表明，水生蔬菜有很强的富集能力，对常量金属元素平均富集系数为2～150倍；稀有元素平均富集量总体上高于陆生蔬菜[14]。同时研究表明部分十字花科植物具有较强的硒积累能力[7-9，15]。鉴于此，本试验以十字花科水生野菜豆瓣菜为研究对象，探究不同硒浓度处理对豆瓣菜生长、硒富集的影响，以期了解豆瓣菜硒积累与耐受特性，并筛选出有利于其生长的最佳硒浓度。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试土壤为水稻土，取自四川农业大学成都校区农田（30°71′N，103°86′E），pH 7.42，有机质 31.73 g/kg，全氮 1.05 g/kg，全磷 0.37 g/kg，全钾 25.71 g/kg，碱解氮56.13 mg/kg，速效磷 17.15 mg/kg，速效钾 56.65 mg/kg，全硒0.35 mg/kg。土壤理化性质按照参考文献[16-17]的方法测定。

豆瓣菜植株盆栽于四川农业大学成都校区大棚，植株健壮，未受硒污染，无病虫害。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试验于2016年9—12月在四川农业大学温江校区进行。2016年9月，将土壤风干、压碎、过5 mm筛后，分别称取3.0 kg装于10 cm×22 cm（高×直径）的塑料盆内，每盆施入无机复合肥3 g作基肥，之后加入分析纯Na2SeO3溶液，使其与土壤充分混匀，保持淹水状态，自然放置平衡4周后再次混合备用。土壤中加入的四价硒浓度分别为 0（CK）、5、10、25、50、75、100 mg/kg。2016年10月，选择长势一致，约 5 cm长的枝条扦插至盆中，每盆扦插3株，每个处理重复6次。盆随机摆放于温室，盆间距10 cm，每7 d交换位置以减弱边际效应的影响，保持淹水2 cm。试验过程中未受硒污染与环境胁迫，及时除草、防虫。

1.2.2 样品采集及测定方法

60 d后测定豆瓣菜叶片光合色素含量，并选取每株豆瓣菜植株顶部幼嫩叶片测定抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性，考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白含量[18]。之后整株收获，将豆瓣菜根、茎、叶分离并用自来水洗净，再用去离子水冲洗3次。之后于110℃杀青15 min，75℃烘干至恒重，称重，粉碎，过0.149 mm筛备用。称取烘干样品，采用硝酸-高氯酸消煮，氢化物原子荧光光谱法测定豆瓣菜各部分硒含量[19]。称取烘干地上部，采用蒽酮比色法测定豆瓣菜地上部可溶性糖含量[20]。

1.3 数据处理方法

每个处理使用每盆中3株豆瓣菜平均数据作1个重复用于数据分析。数据采用SPSS进行方差分析（Duncan新复极差法进行多重比较），用Pearson检验进行相关性分析。

根冠比=根部生物量（g/株）/地上部生物量（g/株）

转运系数=植物地上部分硒含量（mg/kg）/根部硒含量（mg/kg）

硒积累量（μg/株）=硒含量（mg/kg）×生物量（g/株）

2 结果与分析

2.1 不同浓度硒处理对豆瓣菜生物量的影响

由表1可知，不同浓度硒处理后，豆瓣菜各部分生物量均呈先上升后下降的趋势。其中根部生物量仅在硒浓度为10 mg/kg时显著高于（P＜0.05）对照，茎秆生物量除硒浓度为100 mg/kg时显著低于（P＜0.05）对照外，其余各处理均较对照显著提高（P＜0.05）。就叶片而言，当硒浓度为5～25 mg/kg时，其生物量较对照显著提高（P＜0.05），而100 mg/kg则显著降低（P＜0.05）。地上部生物量在5～50 mg/kg硒浓度处理后均显著提高（P＜0.05），其中以10 mg/kg效果最佳，该处理地上部生物量较对照提高16.97%（P＜0.05）。100 mg/kg处理对豆瓣菜造成的毒害最严重，使其根部与地上部生物量分别降低 36.27%（P＜0.05）、7.77%（P＜0.05）。豆瓣菜根冠比在施硒处理后均低于对照（P＜0.05），且随着硒浓度的上升呈下降趋势。

2.2 不同浓度硒处理对豆瓣菜光合色素含量的影响

由表2可知，豆瓣菜光合色素含量随硒浓度上升均呈先升后降的趋势，且在硒浓度为10 mg/kg时有最大值，这与豆瓣菜生物量类似。在硒浓度为0～50 mg/kg范围内，各处理间叶绿素与类胡萝卜素含量差异均不显著（P＞0.05）；而当硒浓度为 75～100 mg/kg时，则显著下降（P＜0.05）。就叶绿素a/b而言，各处理与对照间无显著差异（P＞0.05），但10 mg/kg与25 mg/kg处理的结果显著大于（P＜0.05）75 mg/kg与100 mg/kg。

表1 不同浓度硒处理下豆瓣菜生物量Table1 N.officinale biomass under different concentrations of Se

表2 不同浓度硒处理下豆瓣菜光合色素含量Table2 N.officinale photosynthetic pigment content under different concentrations of Se

2.3 不同浓度硒处理对豆瓣菜叶片抗氧化酶活性与可溶性蛋白含量的影响

5～25 mg/kg的外源硒处理未使豆瓣菜叶片SOD活性较对照显著降低（P＜0.05），而当硒浓度升高至50～100 mg/kg时，SOD 活性显著降低（P＜0.05）（表 3）。豆瓣菜叶片POD与CAT活性随处理浓度的升高均呈先上升后下降的趋势。叶片POD活性除100 mg/kg外其余各处理酶活性均较对照显著升高（P＜0.05），其中以10 mg/kg与25 mg/kg的POD活性最高，分别较对照提高了 35.93%（P＜0.05）、36.91%（P＜0.05）。叶片CAT活性在硒浓度为10 mg/kg时显著高于（P＜0.05）对照，而 100 mg/kg时则显著低于（P＜0.05）对照。外源硒处理均显著降低（P＜0.05）了豆瓣菜叶片可溶性蛋白含量，在硒浓度5～100 mg/kg范围内，呈先升后降的趋势，其中10 mg/kg与25 mg/kg处理的可溶性蛋白含量显著大于（P＜0.05）其余施硒处理。

表3 不同浓度硒处理下豆瓣菜叶片抗氧化酶活性与可溶性蛋白含量Table3 N.officinale leaf antioxidant enzyme activity and soluble protein content under different concentrations of Se

2.4 不同浓度硒处理对豆瓣菜地上部可溶性糖含量的影响

由图1可知，不同浓度硒处理后豆瓣菜地上部可溶性糖含量较对照均降低，且随硒浓度的升高其含量呈先下降再上升最后持续降低的趋势。除硒浓度为25 mg/kg处理外，其余各处理与对照间的差异均达显著水平（P＜0.05），其中以100 mg/kg处理的地上部可溶性糖含量最低。各施硒处理间可溶性糖含量表现为10、25 mg/kg硒浓度处理显著高于（P＜0.05）75、100 mg/kg处理。

图1 不同浓度硒处理下豆瓣菜地上部可溶性糖含量Figure1 N.officinale shoot soluble sugar content under different concentrations of Se

2.5 不同浓度硒处理对豆瓣菜硒含量的影响

由表4可知，外源施硒后，豆瓣菜根、茎、叶、地上部硒含量较对照均显著提高（P＜0.05），且硒含量随着外源硒浓度的升高而升高。统计分析表明，豆瓣菜根、茎、叶、地上部硒含量与外源硒浓度在0.01水平上均呈显著正相关，其相关系数（r）分别为0.999、0.990、0.998、0.996。由此可见，外源硒浓度在0～100 mg/kg范围内，豆瓣菜各部分硒含量与外源硒浓度呈极显著线性关系。就转运系数来说，在硒浓度0～100 mg/kg范围内均小于1，且随硒浓度的升高总体呈先下降再上升最后再下降的趋势。各施硒处理的转运系数均显著低于（P＜0.05）对照，其中以25 mg/kg处理的转运系数显著高于（P＜0.05）其余各施硒处理。

2.6 不同浓度硒处理对豆瓣菜硒积累量的影响

由图2可知，外源施硒后豆瓣菜根部及地上部硒积累量随硒浓度的升高而升高，这一结果与硒含量类似。统计分析表明豆瓣菜各部位硒积累量与外源硒浓度在0.01水平上均呈显著正相关，以yr表示豆瓣菜根部硒积累量，ys表示其地上部分硒积累量，x表示硒浓度，其根部及地上部分硒积累量随外源硒浓度变化的函数关系如下：yr=1.627x+16.472（r=0.983，P=0.000 07）、ys=1.542x+8.522（r=0.985，P=0.000 05）。

3 讨论

对于大多数蔬菜来说，适宜浓度的硒能促进植株生长，但过量的硒会对植株产生毒害，这一结果在番茄、莴苣、菠菜、白菜、胡萝卜等蔬菜作物上已得到证实[21-24]。本试验中豆瓣菜也表现为适宜浓度的硒促进其生长，过量浓度则抑制生长，但与一般蔬菜不同，豆瓣菜表现出了对高浓度硒更强的耐性，这是表明豆瓣菜为硒富集植物的重要依据。蛋白质是生命的物质基础，蛋白质的生理功能体现在通过二硫键、氢键、范德华力等形成一定的结构，多肽链之间或内部的正常二硫键由硫氢基两两形成[25]。在一般植物中，硒不加区分地替代了硫的功能，以硒氨基酸的形式组合进入蛋白质，导致二硫键无法形成，使得蛋白质不正确折叠，相应的蛋白质和酶失去原有的功能，对植物造成毒害；而硒富集植物则将硒转化为硒甲基半胱氨酸等非蛋白氨基酸，从而对高浓度的硒有很强的耐性[26-27]，因此一般植物对硒很敏感，低浓度的硒就能对一般植物造成毒害。有研究表明，外源添加亚硒酸钠使土壤硒添加浓度为20 mg/kg时，小白菜、芥菜、生菜与菠菜的地上部、地下部生物量均显著降低[28]，并且一般非富硒植物硒含量＞50 mg/kg就会使植物中毒，影响生长[15]。本试验中，当外源硒浓度为25 mg/kg时，豆瓣菜根部与地上部硒含量分别为170.29、71.22 mg/kg，但该浓度下豆瓣菜并未受毒害，其地上部生物量反而显著升高（P＜0.05）。而当硒浓度高达 75 mg/kg，豆瓣菜地上部硒含量为158.49 mg/kg时，其地上部生物量任未显著降低（P＞0.05），由此可见豆瓣菜对高浓度的硒具有很强耐性，初步判断为硒富集植物。同时由于豆瓣菜根部硒含量高于地上部，因此适宜浓度的硒更有利于豆瓣菜地上部的生长而过量的硒对豆瓣菜根部的毒害作用更明显，使得豆瓣菜根冠比随着外源硒浓度的升高而降低。总的来说，外源硒浓度为5～50 mg/kg均有利于豆瓣菜生长，其中以10 mg/kg效果最佳。

表4 不同浓度硒处理下豆瓣菜硒含量Table4 N.officinale Se content under different concentrations of Se

图2 不同浓度硒处理下豆瓣菜硒积累量Figure2 N.officinale Se accumulation under different concentrations of Se

光合色素含量是评价光合作用的重要因素，能从侧面反映出植物的生长状况。本试验结果表明外源施用一定浓度（5～50 mg/kg）的硒虽能提高豆瓣菜光合色素的积累，但未达到显著水平（P＞0.05）。而当硒浓度过高时（75～100 mg/kg）就会对豆瓣菜光合色素造成不利影响，影响其光合作用，进而影响其生长。硒对叶绿素含量的影响可能与硒作用于叶绿素合成过程中两种重要的含巯基的酶有关[29]，同时台培东等[30]的研究表明，低浓度的硒能促进叶绿素前体 ALA（δ-aminolevalinic acid）的合成，但浓度过高则会对ALA的合成产生抑制作用。在光合作用中，只有少数特殊状态的叶绿素a可以吸收光能并将之转化，而大多数的叶绿素a和全部的叶绿素b只能传递光能[31]，本试验结果显示硒浓度为10、25mg/kg的处理较75、100 mg/kg的豆瓣菜叶绿素a/b的比值更高，因此适宜浓度（10、25 mg/kg）的硒处理更加有利于豆瓣菜光能的吸收，从而促进豆瓣菜生长。

硒与重金属类似，能使硫醇发生强烈的氧化还原反应，以二价硒化物形态为氧化催化剂，继续氧化诸如GSH之类的硫醇，还原氧产生自由基超氧化合物（O2-）[32-33]，从而影响酶和蛋白质的活性。在植物体内，SOD、POD和CAT共同组成活性氧清除系统，有效清除自由基和过氧化物，其活性高低与硒胁迫下植物抗逆性大小有一定相关性[34-35]。本试验中，适宜浓度的硒能诱导POD（硒浓度5～75 mg/kg）和CAT（硒浓度10 mg/kg）活性的上升，有利于其抵抗逆境，这可能是豆瓣菜能耐受高浓度的硒的原因之一。但过高浓度的硒会导致SOD（硒浓度50～100 mg/kg）和CAT（硒浓度100 mg/kg）活性下降，说明硒对豆瓣菜抗氧化酶的影响存在剂量效应。植物组织内的酶蛋白多为可溶性蛋白，当外源施硒后，豆瓣菜可溶性蛋白含量显著下降（P＜0.05），但外源硒浓度为5～25 mg/kg的豆瓣菜的生物量及抗氧化酶活性却并未降低。这是由于硒富集植物大量合成含硒游离氨基酸，使得可溶性蛋白合成原材料减少，但起初一些重要的蛋白质及酶并未受其影响，而当硒浓度过高时，硒的毒害作用便表现出来。这也解释了施硒处理的豆瓣菜可溶性蛋白含量呈先升高后持续降低的趋势。可溶性糖是参与植物渗透调节的重要物质[36]，当外源硒浓度较低时，并不能引起豆瓣菜的防御性反应，而是直接影响可溶性糖结构或抑制了其合成，因此可溶性糖含量下降；随着硒浓度的上升，豆瓣菜的保护机制启动，可溶性糖大量合成从而保护其细胞免受损伤；而当硒浓度进一步升高，胁迫加重使得这种防御措施失效，导致可溶性糖含量随着硒浓度升高持续降低。

植物对不同化学形态的硒存在不同的吸收机制，有研究表明，正四价的硒大多通过特殊的阴离子转运通道以被动扩散形式渗透到植物细胞内[26，37]。本试验中，外源施硒能显著地提高（P＜0.05）豆瓣菜硒含量，且硒含量与外源硒浓度呈极显著线性正相关，这一结果是四价硒（Ⅳ）的吸收机制所决定的，细胞外高浓度的硒更有利于豆瓣菜对硒的吸收；同时这一结果也揭示了外源硒浓度与豆瓣菜各部位硒含量紧密的联系（0～100 mg/kg范围内），为生产特定硒含量的豆瓣菜提供了参考。不同形态的硒在植物体内的运输与分布也存在差异，其中四价硒（Ⅳ）先转化为六价硒（Ⅵ）及有机硒化合物才能运输到地上部，其吸收速率大于转化速率，因此大部分在根部积累[15，38]，这种转化特性解释了豆瓣菜硒转运系数均小于1这一结果。同时，这一转运过程受硒的调控，当外源硒浓度较低时，豆瓣菜转运能力低，而当硒浓度上升到一定时，硒的转运能力被显著地提高（P＜0.05），但这种调控机制还有待进一步研究。有研究表明，蔬菜虽然可以吸收并积累硒，但一般非富硒植物体内硒含量不超过25 mg/kg，即使生长在富硒土壤中也不会超过100 mg/kg[11]，本试验中外源硒浓度为100 mg/kg时豆瓣菜地上部分硒含量为213.18 mg/kg，根部硒含量高达651.55 mg/kg，因此进一步证明豆瓣菜为一种次生硒富集植物。与硒含量类似，硒积累量与硒浓度（0～100 mg/kg范围内）呈显著正相关。但随着硒浓度的继续升高，即硒浓度高到严重影响豆瓣菜生长时，硒积累量将不会继续升高甚至反而降低，具体变化趋势有待进一步研究。

综上所述，豆瓣菜对硒的耐受范围广、富集能力强，是一种次生硒富集植物，其硒含量、硒积累量与外源硒浓度呈极显著线性正相关。适宜浓度的硒有利于豆瓣菜生长，当外源硒浓度为10 mg/kg时，效果最佳。