氟菌·霜霉威对烟草黑胫病的防效及其对烟株生长的影响

任晓芬，亓文哲，程星凯，刘政军，姬小雪，乔康

1 山东农业大学，植物保护学院，山东泰安 271018;2 山东泰阳生物科技有限公司，山东泰安 271000

烟草黑胫病（Tobacco black shank）是由寄生疫霉（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）引起的危害烟草生产的重要病害，严重影响烤烟的产量和质量[1]。当前防治烟草黑胫病的主要措施仍为化学防治，如常规药剂甲霜灵和烯酰吗啉等[2]。近年研究发现常规杀菌剂在长期、高频率使用下，对烟草黑胫病防效显著降低，病原菌已对其产生不同程度的抗药性[3]。因此，为保障烟叶生产的可持续发展，亟需筛选出具有新作用机理的杀菌剂替代当前常规药剂。

氟菌·霜霉威（62.5 g/L氟吡菌胺+625 g/L霜霉威盐酸盐）是由德国一家公司研发的酰胺类复配剂。氟吡菌胺的穿透性、传导性强，对病原菌的各形态均表现出很好的抑制作用[4]。霜霉威盐酸盐可以被植株叶片和根系快速吸收，在植株体内的上下传导，能为植株的叶片、根茎等提供全面保护[5]。闫磊等[6]曾报道，氟吡菌胺和霜霉威盐酸盐两种单剂混用可有效防治黄瓜霜霉病，且防效优于单独施用。目前，氟菌·霜霉威在烟草上处于试验（试用）阶段，尚未正式登记，其对黑胫病的防治效果有待进一步研究。本试验通过室内毒力和温室盆栽试验明确氟菌·霜霉威对烟草黑胫病的防效及其对烟株生长、烟草叶片防御酶活性的影响，探明氟菌·霜霉威作为替代药剂用于防治烟草黑胫病的潜力，为其合理使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试病原菌

烟草黑胫病菌采集自山东潍坊、泰安、临沂3地的烟草病株，本研究根据许学明[7]建立的烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性基线，得出所采集的烟草黑胫病菌株的抗性倍数在3.15～42.77之间。参照战徊旭等[8]对菌株敏感性划分标准，筛选出对甲霜灵抗性倍数最大的菌株（抗性倍数42.77倍，＞20，属高抗菌株）。将该菌株的采集地记录为潍坊市诸城市郝戈庄镇，置于4℃冰箱保存，备用。

1.1.2 供试烟草品种

小黄金1025，为烟草黑胫病易感品种，由山东农业大学烟草研究室提供。

1.1.3 供试培养基

燕麦琼脂（OA）培养基。

1.1.4 供试药剂

98%甲霜灵原粉、90%精甲霜灵原油和97%烯酰吗啉原粉，山东省联合农药工业有限公司提供；98%氟吡菌胺原粉和92%霜霉威盐酸盐原粉，济南绿霸农药有限公司提供；混剂原粉（98%氟吡菌胺原粉和92%霜霉威盐酸盐原粉以质量比1∶10混合），由山东农业大学农药毒理与应用技术省级重点实验室配制。25%甲霜灵可湿性粉剂、50%烯酰吗啉可湿性粉剂、687.5 g/L氟菌·霜霉威悬浮剂，购于德国拜耳作物科学公司。

1.2 试验方法

1.2.1 杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响

采用菌丝生长速率法。预试验中根据Sun等[9]共毒系数计算法得出原药氟吡菌胺和霜霉威盐酸盐质量比为1∶10时表现出最大增效。结合预试验结果，用丙酮溶解各原药，制备1×104mg/L的母液，并确定杀菌剂的有效系列浓度梯度，用无菌水进行稀释。在无菌操作条件下，制备含药培养基，并接种菌饼至含药平板中央。以无菌水为对照，每处理重复3次，该室内毒力试验重复2次。最后置于（27±1℃）恒温培养箱内进行培养，5 d后采用十字交叉法测量菌落直径，求出药剂对烟草黑胫病菌的EC50值等。

1.2.2 氟菌·霜霉威对烟草黑胫病的盆栽防效试验

将生长一致的6叶烟苗移栽至花盆中，缓苗1周后分别用甲霜灵375 g a.i./hm2、烯酰吗啉300 g a.i./hm2及氟菌·霜霉威 386.7 g a.i./hm2、773.4 g a.i./hm2以每株喷洒30 mL药液对烟苗进行喷淋茎基部处理，以甲霜灵作为对照药剂，清水处理作为空白对照，定义施药当天为施药0 d。3 d后，将烟草黑胫病菌孢子悬浮液（106cfu/mL）以每株50 mL接种至烟苗茎基部，脱脂棉保湿48 h，置于温度（27±1℃），相对湿度95%的温室中培养。盆栽试验共施药一次，每个处理均设4组重复，每组重复20株烟苗。于施药后28 d记录烟草黑胫病的发病率和病情指数。按照下列公式进行计算。

1.2.3 氟菌·霜霉威对烟草生长的影响

于施药0 d、7 d、14 d、21 d观察记录烟株生长情况，并将施药28 d烟草株高、茎粗、有效叶片数及光合速率等指标进行统计处理。

1.2.4 烟草抗病相关酶的活性测定

制备粗酶液参照刘太国等[10]方法。分别于施药0 d、7 d、14 d、21 d、28 d取烟草植株由上向下第3～5片展开叶，置于-20℃保存，用于测定多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）的含量。每个处理重复3次。PPO活性的测定参考Aoariciocuesta的方法[11]；POD活性的测定参考愈创木酚法[12]；SOD活性测定采用NBT 光化还原法[13]：MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[14]。

1.3 数据处理

数据采用SPSS16.0软件的最小显著差数法（LSD）进行单因素方差分析（ANVOA）。

2 结果与分析

2.1 杀菌剂对烟草黑胫病菌的室内毒力

结果表明杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长均表现出抑制作用（表1）。其中，氟吡菌胺和霜霉威盐酸盐以质量比1∶10的比例混用时，对菌丝生长的抑制效果最佳，EC50值为0.06 mg/L。氟吡菌胺和霜霉威盐酸盐两种单剂对病菌菌丝的EC50值分别为0.20 mg/L和3.30 mg/L，毒力低于两种药剂混用。此外，精甲霜灵和烯酰吗啉对病菌的EC50值为0.70、2.02 mg/L，而甲霜灵对菌丝生长抑制效果较差，其EC50值为10.22 mg/L。

表1 6种杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响Tab.1 Effect of six fungicides on mycelial growth of Phtophthora nicotianae

2.2 氟菌·霜霉威对烟草黑胫病的温室盆栽试验

2.2.1 氟菌·霜霉威对烟草黑胫病的防治效果

由图1可知，各杀菌剂对烟草黑胫病表现出不同的防治效果。其中，氟菌·霜霉威-773.4处理能够显著降低烟草黑胫病的发病率，其防效达81.50%（图1a），其次是氟菌·霜霉威-386.7处理，防效为73.67%，氟菌·霜霉威处理的防效均高于烯酰吗啉（67.83%）和甲霜灵（55.75%）。

图1 氟菌·霜霉威对烟草黑胫病的盆栽防效Fig.1 Effects of the combination of fluopicolide and propamocab hydrochloride control efficiency of tobacco black shank in greenhouse

2.2.2 氟菌·霜霉威对烟株生长指标的影响

盆栽结果表明，施用杀菌剂处理的烟草植株在株高、茎粗、有效叶片数、光合速率等指标上相比于空白对照均有不同程度的增加（图2）。氟菌·霜霉威-773.4处理的烟草植株平均株高、平均茎粗分别是23.87 cm、12.83 cm（图2a、图2b），分别比甲霜灵增加了47.89%，18.24%，且该处理的光合速率值（7.94 μmol/m2·s）最高（图2d），因此有利于提高烟叶光合产物的积累量。氟菌·霜霉威-386.7处理比甲霜灵处理能够显著提高株高和茎粗，对烟株表现出良好的促生效果。烯酰吗啉处理在株高、光合速率值均低于氟菌·霜霉威-773.4处理。

2.2.3 氟菌·霜霉威对烟草叶片防御酶活性及MDA含量的影响

由图3可知，整体来说施用氟菌·霜霉威能增强烟草叶片防御酶活性并降低MDA含量，防御酶的活性随氟菌·霜霉威施用剂量的增加呈现出先升高后降低的趋势，且随药剂剂量的上升其影响效果也越显著。氟菌·霜霉威处理的烟叶PPO活性在施药7 d 、14 d、21 d和28 d均高于甲霜灵处理（图3a），且在施药14 d时达到最大值122.42 U/（g·min FW），是空白对照PPO活性的1.97倍，表明氟菌·霜霉威能够提高烟株PPO活性。在施药14 d内，氟菌·霜霉威能够显著增强烟株的POD活性（图3b），其POD活性最大可达空白对照的2.07倍，在施药14 d后各处理的烟草POD活性均呈下降趋势，但氟菌·霜霉威处理的POD值仍高于其他处理。接种病原菌后，氟菌·霜霉威在773.4 g a.i./hm2剂量时，烟草叶片的SOD含量在施药14 d时达到峰值1.95 U/g （图3c），比对照高22.73%。与空白对照相比，氟菌·霜霉威处理能够显著降低烟草叶片内的MDA的含量，最低可达1.18 μmol/g。

图2 氟菌·霜霉威对烟草株高、茎粗、有效叶片数、光合速率的影响Fig.2 Effects of the combination of fluopicolide and propamocab hydrochloride on tobacco plant height, stem diameter, effective leaves and photosynthetic number in greenhouse

图3 不同处理对烟草叶片防御酶活性及丙二醛含量的影响Fig.3 Dynamic curve of tobacco protective enzyme activities and content of MDA after different fungicides treatment

3 讨论与结论

近年研究发现烟草黑胫病病原菌对常规杀菌剂已经产生不同程度的抗药性。Yang等[15]发现烟草黑胫病菌株已对甲霜灵产生抗药性；胡燕等[16]也证明了烟草黑胫病菌对烯酰吗啉存在抗性风险。而氟菌·霜霉威作为一种高效、广谱的复配杀菌剂，已应用于辣椒疫病和马铃薯晚疫病等多种病害的防治[17-18]，但尚未登记于烟草黑胫病的防治。本研究结果表明氟吡菌胺和霜霉威盐酸盐两种单剂均能抑制黑胫病菌丝生长，且两种药剂混用时对菌丝生长的EC50值仅为0.06 mg/L，显著优于单独使用的效果。温室盆栽试验也表明氟菌·霜霉威在推荐剂量773.4 g a.i./hm2时能有效防治烟草黑胫病，且防效显著优于甲霜灵和烯酰吗啉处理。

植株株高、茎粗、有效叶片数等是评价作物生长情况最基本的指标。本研究结果表明氟菌·霜霉威处理能够提高烟草植株的株高、茎粗、有效叶片数等生长指标，促生效果显著。刘波微等[19]的研究表明氟菌·霜霉威对作物具有保产增收的作用。植物抗逆境能力与PPO、POD及SOD等防御酶的活性高低有关，植物新陈代谢产生的活性氧会对细胞产生毒害作用[20]。本试验结果表明，氟菌·霜霉威处理的烟草叶片PPO、POD和SOD活性均较对照组有所提高，这也可能是其促进烟草生长的原因。因此，氟菌·霜霉威可作为甲霜灵和烯酰吗啉的替代药剂用来防治烟草黑胫病。