基于高通量测序技术的浓香型和芝麻香型白酒酒曲细菌群落结构分析

李 斌，闫志鹏，李慧星，李绍亮，李学思，郭书贤*

（1.南阳理工学院 生物与化学工程学院，河南 南阳 473004；2.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004；3.河南省宋河酒业股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

酒曲作为白酒酿造的原动力，直接影响到白酒的品质。根据制曲温度的不同，可分为高温大曲（60～65℃）、中高温大曲（55～60℃）、中温大曲（50～55℃）和低温大曲（40～50℃）[1]。大曲中的主要微生物是细菌、霉菌和酵母，根据微生物的种类和生活习性的不同，在酒曲的制作中，保持酒总体风格的同时，要尽量兼顾各种微生物生长需要的适宜的温度、湿度、pH、氧气等，为微生物的生长繁殖创造一个良好的外界环境[2]。浓香型酒曲的细菌主要是乳酸细菌、芽孢杆菌和醋酸细菌，其中芽孢杆菌多数属于耐热的芽孢杆菌属[3]。

传统的平板培养或变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）等技术只能对大曲中少数可以分离培养的菌种进行研究，具有很大的局限性，而高通量测序技术具有高通量、高分辨率的优势，为准确揭示微生物菌群的多样性提供了强有力的手段，能够充分展示微生物菌群的多样性[4]。目前，Rocher 454、Illumina和Iontorrent是广泛应用的高通量测序平台，Miseq是Illumina开发的第二代高通量测序技术，具有成本低、准确率高、操作简便的优点，已被广泛且成功地应用于食品[5]、土壤[6-7]、水资源[8]等的微生物菌群分析。但目前应用高通量测序技术对白酒酿造大曲的细菌的研究报道还比较少，只有陈玲等[9]以浓香型白酒大曲为研究对象，基于16S rRNA基因为目的片段，分别采用微生物指纹图谱分析技术16S rDNA克隆文库法和高通量测序法分析了大曲中细菌微生物群落的组成，得出大曲中的微生物主要分布于厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和蓝藻菌门（Cyanobacteria/Chloroplast）4个菌门。刘延波等[10]采用高通量测序技术分析了浓香型白酒中温曲和高温曲的细菌群落结构，发现中温曲中细菌主要分布于厚壁菌门，变形菌门，蓝藻菌门；高温曲中主要分布于厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、蓝藻菌门、拟杆菌门（Bacteroidetes）和异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）。

因此，本研究采用高通量测序技术，利用Illumina公司Miseq测序平台对浓香型白酒的中高温曲和芝麻香型白酒的高温曲进行研究，分析了两种大曲在白酒酿造过程中主要的细菌构成，建立一套高通量测序技术分析白酒大曲细菌的方法，同时通过数据分析，完整的解析两种大曲中细菌的群落结构。为建立浓香型白酒大曲和芝麻香型白酒大曲的微生物信息数据库，优化大曲的发酵工艺和提升品质提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

浓香型白酒中高温大曲1月龄（Z1）、2月龄（Z2）、4月龄（Z3），芝麻香型白酒高温曲（AA1）：河南省宋河酒业股份有限公司。样品采集后迅速粉碎密封，-20℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

Taq脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：美国Thermo公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取试剂盒：美国OMEGA公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 DNA检测试剂盒：美国Life公司。

1.2 仪器与设备

Mastercycler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Eppendorf公司；Pico-21台式离心机：美国Thermo Fisher公司；GL-88B漩涡混合器：其林贝尔仪器制造有限公司；TND03-H-H混匀型干式恒温器：拓能达科技有限公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一仪器厂；GelDoc-ItTS3凝胶成像系统：美国UVP公司；Miseq高通量测序仪：美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

酒曲中微生物总DNA提取按照OMEGA试剂盒说明书中的方法和步骤进行。

1.3.2 聚合酶链式反应及测序

PCR扩增细菌16S rDNA的V3～V4区域。

PCR引物：Miseq测序平台的通用引物[11]（341F：5'-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG-3'，805R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。

PCR扩增反应体系：10×PCR buffer（5 μL），脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（0.1 mmol/L），Genomic DNA（10 ng），341F（0.5 μmol/L），805R（0.5 μmol/L），PlantiumTaq（0.05 U），用双蒸水补充至50 μL。

PCR扩增条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s，共计5个循环；然后进行94℃变性20s，45℃退火20s，65℃延伸30s，共计20个循环；最后72℃延伸5 min。

PCR产物进行琼脂糖电泳，利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对DNA回收。利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA进行精确定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

1.3.3 数据分析

测序获取原始序列，将双末端序列融合为一个方向的序列并进行质量控制（quality control，QC）。

（1）序列融合，采用Flash1.2.3软件融合双末端序列，通过各样品的barcode使数据回归样品，并对各样品序列做质量控制。

（2）QC分为4个步骤：采用V0.20.4 Prinseq软件对序列阅读框的3'端进行质控，截掉Q值（碱基质量值）低于20的数据，提高后续序列融合比率；通过Flash软件融合双末端序列，使其形成一条序列；采用Prinseq软件去除各样品的引物序列、低于200 bp的序列、低复杂度序列和低质量序列；去除非靶区域序列及嵌合体，首先采用1.30.1Mothur软件的Pre.cluster模块校正测序错误，校正过程当中允许的最大错配为1/150。其次，采用软件Mothur内的Uchime功能模块，以Silva数据库中的序列作为模板，去除嵌合体及非靶区域序列。

2 结果与分析

2.1 序列的拼接

采用Illumina Miseq测序平台得到样本Z1、Z2、Z3、AA1对应的原始序列分别为80 569条、48 223条、48 878条和52178条，其平均长度分别为466.53bp、466.37bp、464.75bp和468.62 bp。经拼接、过滤，分别得到有效序列78 261条、46586条、47109条和50473条，其平均长度分别为426.63bp、427.06 bp、425.95 bp和429.46 bp。

2.2 序列丰富度和多样性分析

基于高通量测序技术对浓香型白酒和芝麻香型白酒酒曲中细菌的测定序列数、操作分类单元（operationaltaxonomic units，OTU）和Alpha多样性指数研究结果见表1。

Shannon指数、ACE指数、Chaol指数和Simpson指数是常用于描述微生物群落物种多样性的Alpha多样性指数，这4个多样性指数可以对群落物种组成的丰富度及群落物种组成的均匀度进行综合性的评价，4个多样性指数中的Shannon指数对微生物群落物种丰富度更为敏感。其中Shannon指数越大，群落物种的多样性越高，而Chaol或ACE指数越大则表明群落物种丰富度越高，由Coverage指数可知本次实验的取样是否合理，若Coverage指数＞97%，则证明本次取样是合理的。但Simpson指数值越大，说明群落多样性越低[12]。

表1 不同酒曲中细菌的序列数、OUT数及Alpha多样性指数分析Table 1 Analysis of sequence number,operational taxonomic unit number and alpha diversity index of bacteria in differentJiuqu

由表1可知，尽管Z1、Z2、Z3、AA1样品对应的Alpha多样性指数在绝对数值上略有差异，但都可以看出测序数据量已足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息。对3个浓香型白酒和1个芝麻香型酒曲样本中的细菌进行测序，共获得197 439条序列，聚类分析共产生2 574个OTU分类。通过对4个样本的对比分析：Z3样本的Shannon指数最大，为3.17，因而Z3样本的细菌群落多样性最高；而Z1样本的Chao1指数和ACE指数最大，分别为1040.64、1174.37，表明Z1样本的细菌群落物种的丰富度最大；4个样本的Coverage指数均＞97%，说明试验的取样是合理的，测序结果能反映样本的真实情况；而AA1样本的Simpson指数最大，为0.51，则证明AA1样本的群落多样性最低。

2.3 香农指数曲线分析

基于高通量测序技术对浓香型白酒和芝麻香型白酒酒曲中细菌的香农指数进行分析，香农指数曲线如图1所示。

香农指数曲线反映样品中微生物多样性的指数，它可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU[13-14]。

由图1可知，随着测序数量的增加，香农指数曲线趋向平坦，说明测序数据量渐进合理。随着测定序列数目的增加，样本Z1、Z2、Z3的Shannon指数值均高于2.5，说明Z1、Z2、Z3号样品的物种多样性和丰富度都较高；Z1样本和Z2样本的香农指数曲线几乎在同一曲线上，这是由于两样本的Shannon指数（分别为3.00和3.02）几乎是相同的，所以微生物群落物种的多样性几乎是一样的。而AA1号样品的Shannon指数值较低，说明AA1号样品的物种多样性较低。

图1 不同酒曲的香农指数曲线Fig.1 Shannon index curves of differentJiuqu

2.4 属水平各样本中细菌的种类和相对丰度分析

基于高通量测序技术的浓香型白酒和芝麻香型白酒酒曲在属的水平上分析细菌的种类和相对丰度，根据丰度将样本中菌属分为优势菌属（丰度≥1.0%）和次要菌属（丰度＜1.0%），且将次要菌属归类于其他（others），其结果见图2～5。

图2 Z1酒曲样本中细菌属及相对丰度Fig.2 Genus and relative abundance of bacteria inJiuquZ1

由图2可知，Z1酒曲样本中相对丰度≥1.0%的优势细菌属有9个，其中乳杆菌属（Lactobacillus）占比最大，为31%；其次为葡萄球菌属（Staphylococcus），所占比例为26%；其余依次为魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）、泛菌属（Pantoea）、片球菌属（Pediococcus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、肠杆菌属（Enterobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）。

由图3可知，Z2酒曲样本中相对丰度≥1.0%的优势细菌属有9个，其中乳杆菌属（Lactobacillus）所占比例最大，为51%；其次为明串珠菌属（Leuconostoc），所占比例为10%；其余依次为葡萄球菌属（Staphylococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pediococcus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspo-ra）、泛菌属（Pantoea）、乳球菌属（Lactococcus）和不动杆菌属（Acinetobacter）。

图3 Z2酒曲样本中细菌属及相对丰度Fig.3 Genus and relative abundance of bacteria inJiuquZ2

图4 Z3酒曲样本中细菌属及相对丰度Fig.4 Genus and relative abundance of bacterial inJiuquZ3

由图4可知，Z3酒曲样本中相对丰度≥1.0%的优势细菌属有8个，其中乳杆菌属（Lactobacillus）所占比例最大，为56%；其次为魏斯氏菌属（Weissella），所占比例为12%；其余依次为片球菌属（Pediococcus）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）和乳球菌属（Lactococcus）。

图5 AA1酒曲样本中细菌属及相对丰度Fig.5 Genus and relative abundance of bacterial inJiuquAA1

由图5可知，AA1酒曲样本中相对丰度≥1.0%的优势菌属比较少，主要是芽孢杆菌属（Bacillus）和别样芽胞杆菌属（Allobacillus），所占比例分别为91%和2%。别样芽胞杆菌属（Allobacillus）是一类革兰氏阳性菌，需氧菌，球形孢子位于末端，具膨胀的孢子囊。氢氧化钾试验和L-丙氨酸氨基肽酶均为阴性。模式种是Allobacillushalotolerans[15]。这个属是近年才确立的，2011年台湾学者SHEU S Y等[15]在虾酱里首次发现Allobacillus halotoleransgen.nov.，sp.nov.，本文首次在芝麻香型高温酒曲里发现该属。

对不同月龄的浓香型白酒酒曲中的细菌菌属种类和相对丰度进行比对分析，结果见表2。

表2 浓香型白酒不同月龄酒曲中细菌菌属及相对丰度Table 2 Genus and relative abundance of bacterial in theJiuquwith different ages

由表2可知，随着浓香型白酒酒曲贮存时间的延长，乳杆菌属（Lactobacillus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、片球菌属（Pediococcus）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）的相对丰度逐渐增加，而葡萄球菌属（Staphylococcus）、泛菌属（Pantoea）、芽孢杆菌属（Bacillus）随贮存时间的延长菌属相对丰度越低。除此之外，明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）的相对丰度是先上升再下降，说明这两类菌属在贮存4个月过程会出现峰值，然后开始下降；魏斯氏菌属（Weissella）则是先下降再上升。

3 结论

本研究基于Illumina MiSeq高通量测序研究了宋河酒业浓香型白酒中高温酒曲和芝麻香型白酒高温酒曲中的细菌群落结构。在属的分类水平上分析，浓香型白酒中高温酒曲的优势类群（丰度≥1%）有9个，主要有乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pedio-coccus）等。芝麻香型白酒高温酒曲的优势类群（丰度≥1%）主要有芽孢杆菌属（Bacillus）和别样芽胞杆菌属（Allobacillus），丰度分别为91%、2%，其中别样芽胞杆菌属（Allobacillus）是首次在酒曲中发现的细菌属，且丰度较高，其特性和功能尚不清晰，有待更加深入地研究。采用高通量测序技术对酒曲中的菌落物种分类研究，操作简单、通量高、信息丰富，和传统方法比较具有一定的优越性。该研究成果为进一步研究优化制曲工艺、提高酒曲质量指明了方向，具有重要的理论和实践意义。