超声波促进巴氏醋杆菌发酵生长的研究

孙 悦，夏 蓉，陶汇源，石吉勇，邹小波*

（1.江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.镇江恒顺生物工程有限公司，江苏 镇江 212013）

食醋是人们日常生活的一种重要调味品，在中国传统食醋酿造中，镇江香醋是米醋的典型代表之一，因其具有“酸而不涩，香而微甜，色浓味鲜，愈存愈香”的特点，受到国内外消费者的青睐。镇江香醋发酵过程中主要分为三个阶段：糖化阶段、酒精发酵阶段、醋酸发酵阶段[1]。前期研究表明，在固态发酵阶段，微生物种群相对稳定，且微生物种类和微生物活性在发酵过程中呈周期性变化[2]。醋酸杆菌是香醋发酵阶段微生物中重要的优势产酸菌属之一，在食醋生产过程中起着关键作用。因此，对生产过程中醋酸杆菌的调控具有重要意义。

近年来，超声波技术已经广泛应用于食品微生物领域。超声波是一种频率高于20 kHz的能量机械波，具有方向性好、穿透能力强、振动强烈等特点[3]。当超声波穿过液体时，这种机械波产生的高频振动会导致物料内部受到快速剧烈的挤压膨胀，产生微射流。由超声产生的微射流会增强细胞的通透性，同时还会加快细胞壁及细胞膜边界层的传质速率，改变细胞的生理代谢，从而强化发酵过程[4-5]。SINISTERRA J V[6]研究表明，超声波可以刺激细胞及酶活，并且可以在细胞边界层或者通过细胞壁和细胞膜改变细胞的代谢、提高物质（物料及产物）传递。同时超声波产生的微射流还可以打散团聚的细胞，提高细胞对营养成分的利用率，增大细胞的生物量。DAI C等[7-8]对超声刺激阿氏假囊酵母（Ecemothecium ashbyii）发酵产生核黄素进行研究，结果表明，在最佳处理条件（超声频率24 kHz）下，超声不仅可以促进菌丝体生长，还可以提高核黄素的产量。DAHROUDA B D等[9]用振幅40%，时间30 s的低强度超声场处理干酪乳酸杆菌（Lactobacillus caseisubsp.）发酵液后证实，低强度超声可以促进乳酸杆菌发酵，其中L-乳酸产量及生物量均提高了约25%。此外，国内外学者进行了超声强化发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）[10]、热带假丝酵母（Candida tropicalis）[4]和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[11-12]的发酵特性及理化特性研究，均取得了明显的促进效果。然而，有关香醋发酵过程中超声强化巴氏醋杆菌（Acetobacterpasteurianus）发酵特性的研究鲜见报道。

因此，本研究以巴氏醋杆菌（A.pasteurianus）为研究对象，采用超声波技术研究超声波功率、超声时间及温度对发酵过程中巴氏醋酸杆菌的生物量、产酸能力及细胞通透性的影响，为镇江香醋发酵过程的控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

巴氏醋杆菌（A.pasteurianus）CICC 20041：购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、酵母提取物、NaCl、琼脂、NaOH、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

液体培养基：葡萄糖1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH 6.8左右，121℃灭菌15 min，等温度降至50℃左右时加入无水乙醇3%。

固体培养基：在液体培养基中加入琼脂2%。

1.2 仪器与设备

BS2000S电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司；T6新世纪型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DSX-280型手提式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司；GHP-9050型隔水式培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HYL-C小型组合式摇床：太仓市强乐实验设备有限公司；KS-120AL超声波设备：深圳市科洁超声科技有限公司；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的培养

从4℃冰箱中保藏的试管斜面菌种中挑取少量菌种A.pasteurianusCICC 20041，在无菌条件下接种于液体培养基中，在37℃条件下培养24 h，得到巴氏醋杆菌培养液。然后以1%的接种量接种于盛有200 mL的液体培养基中，在发酵温度37℃、摇床转速170 r/min条件下培养24 h，得到的巴氏醋杆菌以备后面的试验。

1.3.2 巴氏醋杆菌生长曲线的测定

巴氏醋杆菌在37℃、170 r/min的发酵条件下进行发酵，以未接种菌体的液体培养基作为空白对照，在生长至0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、11 h、24 h、32 h时取发酵液，在波长600 nm处测定吸光度值。绘制巴氏醋杆菌的生长曲线。

1.3.3 巴氏醋杆菌的超声波处理条件优化单因素试验

当接种量为1%的醋酸杆菌在200 mL培养基中发酵至24 h时，取5 mL的发酵液进行超声处理，处理后的样品进行微生物菌落总数计数。分别吸取1 mL未经处理和经过超声处理的菌悬液，用无菌生理盐水稀释到适宜梯度，涂布在固体培养基上，置于恒温培养箱中，在37℃条件下培养24 h，得到经过超声处理后的菌落数为N（CFU/mL），未经处理的菌悬液的菌落数为N0（CFU/mL），以生物量增量（%）来评价超声波对醋酸杆菌的影响。

采用单因素轮换法，分别选择超声时间（5min、10min、15 min、20 min、25 min）、超声温度（25 ℃、40℃、55 ℃）、超声功率（200 W、400 W、600 W、750 W）对培养24 h后的发酵液进行处理，测定生物量增量以确定最适超声条件。

其中为防止超声时间过长热效应引起的温度上升，使用冰袋进行及时降温。

1.3.4 不同生长期超声处理对巴氏醋杆菌产酸能力的影响

将相同浓度的巴氏醋杆菌种子液按接种量1%分别接种到200 mL培养基中，在37℃、170 r/min的条件下摇床培养。每隔一段时间（2 h、5 h、8 h、10 h、20 h、25 h、32 h）分别对发酵液进行超声处理，超声处理条件选择单因素试验优化得到的最佳参数，处理后继续进行摇床发酵，96 h后测定醋酸杆菌在不同生长时期超声处理的总酸含量，以未经超声处理发酵96 h的发酵液中的总酸含量为对照。总酸测定采用标准NaOH溶液滴定法[13]。

1.3.5 超声处理对巴氏醋杆菌细胞通透性的影响

取3 mL发酵24 h时的菌液，稀释5倍，以5 000 r/min的速率离心5 min，取上清液，以未接种菌种的液体培养基为空白，在超声温度为单因素确定的最适温度条件下，测定不同超声时间（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）和不同超声功率（200 W、400 W、600 W、750 W）前后巴氏醋杆菌细胞外液核酸、蛋白质的变化，判断超声处理对细胞膜通透性的影响。

核酸和蛋白质提高率的测定：参考文献[14]，分别在波长260nm和280 nm条件下，测定菌液的吸光度值。核酸提高率的计算公式如下：

式中：R1为核酸提高率，%；a表示未超声处理的菌液在波长260 nm处的吸光度值；b表示经过超声处理后的菌液在波长260 nm处的吸光度值。

蛋白质的提高率计算公式如下：

式中：R2为蛋白质提高率，%；c表示未超声处理的菌液在波长280 nm处的吸光度值；b表示经过超声处理后的菌液在波长280 nm处吸光度值。

2 结果与分析

2.1 巴氏醋杆菌生长曲线

图1 巴氏醋杆菌的生长曲线Fig.1 Growth curve ofA.pasteurianus

巴氏醋杆菌生长曲线如图1所示。由图1可知，巴氏醋杆菌的生长迟滞期较短，说明巴氏醋杆菌可以很快适应新的培养基并快速繁殖生长。对数生长期约为2～15 h，当发酵时间为24h时，菌株处于稳定期，此时期的菌株个体形态及生理指标都相对较为稳定。巴氏醋杆菌的生长曲线符合Logistic模型。

2.2 巴氏醋杆菌的超声波处理条件优化单因素试验

2.2.1 超声时间对巴氏醋杆菌的影响

在超声波功率为400 W，超声温度为40℃的条件下，超声时间对巴氏醋杆菌生物量的影响结果如图2所示。

图2 不同超声时间对巴氏醋杆菌生物量增量的影响Fig.2 Effects of different ultrasound time on the biomass increment ofA.pasteurianus

由图2可知，随着超声时间的延长，巴氏醋杆菌的生物量呈现先增大后减小的趋势，当超声时间为20 min时，巴氏醋杆菌的生物量增量最高，为41.80%，说明将超声波作用于巴氏醋杆菌发酵过程中，在一定条件下可以提高其活菌数量。分析原因可能是在发酵过程中施加超声，超声波产生的高频振动将能量传入细胞内部，细胞内组织结构受到反复的收缩和舒张作用而产生“海绵效应”，从而可以促进细胞内外的物质传递，加速细胞生理代谢反应的进行，从而提高细菌的生物量[15]；当超声时间为5 min时，醋酸杆菌生物量增量为-3.47%，与无超声作用基本相同（P＞0.05），可能是因为超声作用时间较短，超声产生的效应不明显。超声15min和20min的细胞生物量增量无显著性差异（P＞0.05），因此选择最优超声时间为15 min。HUANG G等[16]对超声如何提高热带念珠菌（Candida tropicalis）细胞膜的通透性及生长速率进行了研究，也发现短时间的超声提高生物量的效果较好，长时间的超声会抑制细菌的生长。本试验与其所得结论一致。

2.2.2 超声温度对巴氏醋杆菌的影响

在超声波功率为400 W，超声时间为15 min的条件下，超声温度对巴氏醋杆菌生物量的影响结果如图3所示。

图3 不同超声温度对巴氏醋杆菌生物量增量的影响Fig.3 Effects of different ultrasound temperature on the biomass increment ofA.pasteurianus

由图3可知，随着超声温度的升高，巴氏醋杆菌的生物量增量呈现先增加后减小的趋势。当超声温度为25℃时，巴氏醋杆菌的生物量增量为-18.15%；当超声温度为40℃时，巴氏醋杆菌的生物量增量为31.37%；但当超声温度为55℃时，巴氏醋杆菌的生物量增量仅为-99.88%，说明超声温度对醋酸杆菌的生物量具有影响，尤其是较高温度下的影响更显著（P＜0.05）。朱瑶迪等[17]研究表明，在高温下施加超声会增强超声对醋酸杆菌的致死效果，从而不利于发酵的进行。EVELYN E等[18]研究超声对脱脂牛奶和牛肉中嗜冷芽孢杆菌（Bacillus psychrophilus）的致死效应，发现在较高温度下施加超声可以增强对细菌的致死率。本试验与其研究结果一致。因此选择最优超声温度为40℃。

2.2.3 超声功率对巴氏醋杆菌的影响

在超声时间为15min，超声温度为40℃的条件下，超声波功率对巴氏醋杆菌生物量的影响结果如图4所示。

图4 不同超声功率对巴氏醋杆菌生物量增量的影响Fig.4 Effects of different ultrasound power on the biomass increment ofA.pasteurianus

由图4可知，随着超声波功率的增大，巴氏醋杆菌细胞生物量增量呈现先增大后减小的趋势。其中在较低功率和较高功率条件下，施加超声对醋酸杆菌均有轻微抑制作用。分析原因可能是超声功率太小时，不能有效够刺激细胞内和细胞外物质传递及能量交换[12]，而超声功率过大会导致其空化效应显著，由超声产生的高频振动使得介质中的液体发生快速膨胀和收缩，在介质中产生空泡，超声产生的破坏应力（剪切力）会使空泡产生瞬间爆破，从而形成强大的动能和压缩能[3，19]，破坏细胞的完整性。另外高功率超声还会使水分子裂解产生少量具有强氧化能力的自由基，破坏细胞活性物质的结构，加速细胞死亡[20]。当超声功率为600W时，巴氏醋杆菌生物量相比无超声作用增加了82.35%，表明合适功率的超声波对巴氏醋杆菌具有一定刺激作用。YANG F等[21-22]研究表明，超声的声孔效应会使微生物细胞膜上暂时产生微小孔洞，从而为基本营养物质的传递及有毒有害物质的去除提供通道，提高细胞膜的渗透性。

2.3 不同生长期超声处理对巴氏醋杆菌产酸能力的影响

分别在巴氏醋杆菌发酵2 h、5 h、8 h、10 h、20 h、25 h和32h时，进行超声处理。巴氏醋杆菌不同生长时期进行超声处理对其总酸含量的影响结果如图5所示。

图5 不同生长时期超声处理对巴氏醋杆菌总酸含量的影响Fig.5 Effects of ultrasound treatment on total acid content of A.pasteurianusat different fermentation periods

由图5可知，与对照组总酸含量（21.00 g/L）相比，在巴氏醋杆菌发酵2 h、10 h、20 h、25 h时进行超声处理，均会增加总酸含量，其中在平稳期中期（25 h）总酸含量最多为24.50 g/L，提高率为16.70%。这可能是由于巴氏醋杆菌在发酵对数期中期细胞中酶活较强，导致超声刺激对其影响不显著（P＞0.05）[12]。而随着发酵的进行，进入平稳期后，超声的微流扰动可以将团聚的细胞分散开，使得培养基中的营养物质得到充分利用，从而加快物质的传递与合成速率[15]；同时，超声会使酶的活性发生改变，酶与底物碰撞机率增大，细胞的生理代谢速率增强[22-24]，从而促进醋酸分子的合成。

2.4 超声处理对巴氏醋杆菌细胞通透性的影响

不同超声时间和超声功率对巴氏醋杆菌细胞通透性的影响结果如图6所示。

图6 不同超声时间（a）和超声功率（b）对巴氏醋杆菌细胞通透性的影响Fig.6 Effects of different ultrasound time(a)and ultrasound power(b)on cell permeability ofA.pasteurianus

由图6（a）可知，随着超声时间的增加，细胞外核酸和蛋白质的渗出浓度提高率呈现先降低后升高的趋势，且核酸和蛋白质的提高率基本相同。当超声时间为5 min时，巴氏醋杆菌细胞外液中核酸与蛋白质的提高率最高，分别为4.17%和3.93%，其原因可能是由于在超声时间为5 min时，超声的空化效应和机械效应使得细胞受到瞬时的动能和压缩能，造成表面微伤，使细胞壁局部破裂，从而改变细胞膜的通透性，加速细胞内外核酸和蛋白质等物质的交换速率；当超声时间为10 min时，细胞通透性逐渐恢复到原来的水平，这可能是由于当超声条件适宜时，超声造成的细胞表面伤口较小，能够被醋酸杆菌自身修复，从而抑制核酸和蛋白质的渗出[14]；但随着超声时间的再次增大至15～25 min时，胞外核酸和蛋白质的渗出浓度提高率再次升高，这可能是因为超声对细胞膜的通透性影响逐渐超过了菌体的承受能力[14]。因此选择最优超声时间为15 min。

由图6（b）还知，当超声功率≤600 W时，核酸和蛋白质提高率较小，表明超声功率较小时对细胞的通透性影响不大；然而随着超声功率增大至750 W时，核酸和蛋白质的提高率分别升高至24.6%和28.3%，分析原因可能是当施加较大超声功率时，巴氏醋杆菌细胞膜的通透性受到显著影响（P＜0.05），细胞开始崩解，导致细胞内核酸和蛋白质等物质大量渗出。因此，考虑细胞通透性和生物量，选择600W为最优超声功率。

3 结论

本试验研究了超声波对巴氏醋杆菌生物量、代谢产物及细胞通透性的影响，结果表明，最优超声条件为超声时间15 min、超声温度40℃、超声功率600 W。在此最优超声条件下，与无超声处理相比，巴氏醋杆菌生物量增加82.35%。通过对巴氏醋杆菌不同生长时期进行超声处理，得出在稳定期中期（25 h）进行超声处理时，对巴氏醋杆菌的总酸含量影响显著（P＜0.05），总酸含量提高了16.7%，表明在合适的生长期进行超声处理有利于发酵的进行。超声处理对巴氏醋杆菌细胞外液核酸及蛋白质渗透性的影响结果显示，核酸和蛋白质的提高率均随着超声时间和超声功率的增大呈先降低后升高的趋势。将超声波处理技术应用于巴氏醋杆菌发酵过程中生长特性及代谢产物的研究，对调控香醋发酵、提高产品品质具有一定理论指导和实践价值。