土壤水溶性有机碳的高锰酸钾氧化比色法测定研究

王 星， 孙沙沙， 王桂红， 王萍萍， 郭 振， 焦克强， 段建军， 王小利

(1.贵州大学农学院，贵州贵阳 550025； 2.贵州大学烟草学院/贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州贵阳 550025)

水溶性有机碳(water-soluble organic carbon，简称WSOC)通常是指能通过0.45 mm微孔滤膜的水溶性有机物质[1]，是陆地生态系统极为活跃的有机碳组分，虽然它在土壤中含量很低，一般不超过200 mg/kg[2]，但容易被土壤微生物物吸收和利用[3]，对调节土壤阳离子淋失、土壤中有机和无机物质的转化、迁移和降解也起到重要的作用[4-6]，因此，土壤水溶性有机碳的测定已成为土壤化学性质分析的一个重要项目。

目前，WSOC的测定方法主要有：重铬酸钾-浓硫酸外加热容量法(湿氧化法)[7-8]、总有机碳测定仪(TOC)法测定[9]。湿氧化法由于不能保证样品完全氧化，并且测定所需时间长，很难消除铬和强酸，测定结果误差较大[10]；干烧法有机碳氧化所需温度高，仪器比较昂贵，并且测定之前须对提取液蒸干，操作复杂、费时，整体分析运行成本偏高[11-12]。因此，找到一种廉价、操作简单、具有一定精度的WSOC测定方法对WSOC的研究具有重要意义。

WSOC是一种活性有机碳，目前，土壤活性有机碳常用的测定方法是高锰酸钾氧化比色法[13-14]，即根据土壤与高锰酸钾作用后高锰酸钾的消耗量来计算土壤活性有机碳的含量。本研究在活性有机碳测定的基础上，通过分析高锰酸钾比色液吸收曲线、反应时间、标准曲线的制作等因素，以期创建一种准确、简单、方便的WSOC测定方法。

1 原理

活性有机碳高锰酸钾氧化法测定的具体步骤[15]：取含有15 mg碳土壤样品于离心管中并加入25 mL的333 mmol/L高锰酸钾，振荡或静置一定时间，离心后取上清液用去离子水以1 ∶250稀释，在分光光度计565 nm下测定稀释样品的吸光度，由不加土壤的空白对照与土壤样品的吸光长之差，计算出高锰酸钾浓度的变化，并进而计算出氧化的碳量(氧化过程中高锰酸钾浓度变化1 mmoL可消耗9 mg碳[16])，而土壤中水溶性有机碳的含量一般不超过200 mg/kg，根据假设，在氧化的过程中高锰酸钾浓度变化1 mmol/L可消耗9 mg碳，为此本研究采用4 mmol/L的高锰酸钾氧化水溶性有机碳，从而测定出水溶性有机碳的含量。以草酸溶液、水杨酸溶液为标准物质做参比，土壤样品分别采用高锰酸钾氧化比色法和TOC进行测定，并进行相关统计分析，对新方法进行评价。

式中：B为高锰酸钾浓度变化值(mmol/L)，浓度变化值通过查标准曲线确定；V1为比色液的体积(mL)；9为高锰酸钾氧化碳的比例系数；V2为WSOC浸提的水的体积(mL)；V3为定容时使用的离心上清液的体积(mL)；m为烘干土样质量(g)。

2 材料与方法

2.1 试剂与仪器

4 mmol/L的高锰酸钾溶液。由于高锰酸钾自身氧化性较强，与还原性物质易发生反应，例如空气中的尘埃及氨等还原性物质[17]，影响溶液的稳定性。另外，高锰酸钾溶液见光易分解，很难长期稳定保存，所以本实验使用的高锰酸钾溶液均为现配现用，并避光保存。所用水均为蒸馏水。吸光度的测量和波长的扫描均采用分光光度计。

2.2 试验方法

2.2.1 高锰酸钾比色波长和反应时间的确定 配制 4 mmol/L 的高锰酸钾溶液100 mL，吸取5 mL于100 mL容量瓶用蒸馏水定容；定容后的溶液在450～600 nm波长范围内扫描(1 cm比色杯)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图得到高锰酸钾的吸收曲线，曲线描述了高锰酸钾对不同波长光的吸收能力。

取0.90、1.35 mg/L的草酸溶液分别与高锰酸钾溶液反应，每30 min测定吸光度，直至反应完全，绘制在室温条件下比色测定结果与显色时间的关系图，从而确定显色时间。

2.2.2 高锰酸钾标准曲线的制作 首先配制4 mmol/L的高锰酸钾标准溶液，从标准溶液中吸取3、4、5、6、7、8 mL标准溶液转移至100 mL容量瓶中，并用蒸馏水定容(对应的浓度分别为0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mmol/L)，溶液同“2.2.1”节比色测定。以吸光度为横坐标，高锰酸钾浓度为纵坐标制作标准曲线。

3 结果与分析

3.1 高锰酸钾氧化比色法的吸收曲线和反应时间

同一物质的吸收曲线随波长的变动而变动，应取吸光度最大时对应的波长，此时比色更精确。本试验中4 mmol/L高锰酸钾的吸收曲线见图1。从图1可以看出，在480 nm～530 nm 处出现2个吸收峰，其中在490 nm和525 nm吸收值相差不大，因此在比色的时候，可以选择在490 nm、525 nm处进行测定。

待测液与4mmol/L高锰酸钾溶液的反应时间对于比色测定结果也有很大影响，如果反应时间太短，待测液反应不完全，造成结果偏低；反应时间太长，已经稳定的颜色就可能会褪去，导致结果偏高。由于水溶性有机碳的含量比较低，所以要保证待测液的量完全被高锰酸钾所氧化，在本试验中 4 mmol/L 的高锰酸钾溶液理论上最多消耗2.16 mg的C。配制0.90 mg/L、1.35 mg/L的草酸溶液反应与高锰酸钾的反应时间见图2。

由图2可见，0.90、1.35 mg/L的草酸溶液分别与高锰酸钾反应在0～2 h内吸光度均呈下降趋势；在2～8 h内，2种溶液吸光度基本保持稳定，差异不显著(P<0.05)。

为进一步确定显色时间，在0.5、1、1.5、2、8 h测定2种不同浓度待测溶液的水溶性碳的值，结果如表1所示，在0.5、1 h时，2种待测液测定值比标准值小，并且相差比较大，可能是反应时间太短，样品反应不是很完全；而在1.5、2、8 h时，2种待测液的测定值均与标准值相差不大，这说明在 1.5～8 h 时，溶液中的碳已反应完全，而在 2 h 时水溶性有机碳的回收率高于1.5 h时的回收率且测定值也更接近理论值，因此比色时间取2 h即可，能达到节能、高效的效应。

表1 不同时间下可溶性碳的测定值

注：平均值为C浓度，回收率指测量值占标准值的百分数。

3.2 不同种类有机碳化合物高锰酸钾氧化比色法与TOC仪器法测定结果的比较

分别配制0.45、0.90、1.35 mg/L的草酸溶液、水杨酸溶液比色测定(每个浓度梯度设置10个平行)，并与理论含碳值和TOC仪器法测定结果进行比较分析。

表2结果显示，TOC仪器法测定6种样品的测定结果均高于高锰酸钾氧化比色法的测定结果，高锰酸钾氧化比色法测定的样品回收率小于TOC仪器法测定结果，这说明TOC仪器法对有机碳氧化得更完全。高锰酸钾氧化比色测定结果和TOC仪器法测定结果之间呈极显著相关性，与TOC仪器法测定结果的相对偏差相比，高锰酸钾氧化比色法的相对偏差更大，这说明TOC仪器法更加稳定，因此当测量精确度要求不高的时候，也可采用高锰酸钾氧化比色法测定水溶性有机碳。并且从表2可以看出，高锰酸钾氧化比色测定的回收率都高于80%，同种浓度的草酸和水杨酸相比，水杨酸的回收率都高于草酸。

表2 不同浓度的草酸和水杨酸高锰酸钾氧化比色测定与TOC仪器法测定结果比较

3.3 WSOC高锰酸钾氧化比色法测定与TOC测定结果的比较

以贵州普定县陈家寨喀斯特小流域为研究区域，在耕地、果园、荒草地、灌木林地和人工林这5种土地利用方式下各取9个土壤样品，共计45个样品，称取5 g(干质量)土样，加入 2 400 mL 蒸馏水，于常温下振荡30 min，4 000 r/min离心 10 min，上清液过0.45 μm的滤膜，浸提液中有机碳采用高锰酸钾氧化比色法测定。高锰酸钾氧化比色法测定结果和TOC仪器法测定结果比较见表3。

高锰酸钾氧化比色法测定45个WSOC含量在0.02～0.4 mg/g 之间，TOC仪器法的测定结果为0.04～0.56 mg/g。2种方法测定的45个土样水溶性有机碳含量的高低变化基本一致，但TOC仪器法的测定水溶性有机碳含量的平均值高于高锰酸钾氧化比色法测定的结果，这可能是因为TOC高温燃烧把水溶性有机碳氧化得更完全。高锰酸钾氧化比色法的变异系数值为61.53%，高于TOC测定的变异系数值。在配对样品的t检验方面，二者的相关性高达0.941，重复取样的显著性P>0.05，说明2种方法测定的结果不存在显著性差异，具有良好的一致性。应用线性方程拟合高锰酸钾氧化比色法和TOC法所测的土壤水溶性数据，发现二者线性拟合较好(图3)。

表3 WSOC高锰酸钾氧化法与TOC仪器法的测定结果比较

高锰酸钾氧化比色法测定的WSOC结果偏低，可以通过图3线性方程的关系进行矫正，即高锰酸钾氧化比色法测定的WSOC结果乘以1.28等于TOC仪器法的测定结果。

4 讨论与结论

借鉴土壤活性有机碳的高锰酸钾氧化比色法，探索并确定了土壤水溶性有机碳的高锰酸钾氧化比色法，在测定WSOC值时，波长可选择490 nm和525 nm，显色在2 h即可。已知碳浓度的有机化学试剂与高锰酸钾氧化比色时，相同浓度的水杨酸比草酸的回收率更高，这可能是由于含脂肪链的草酸与高锰酸钾反应没有水杨酸敏感，但是不同浓度的草酸和水杨酸与高锰酸钾氧化比色得到的含碳值和其理论的含碳值相差不大，占理论值的80%以上，这也说明氧化的过程中高锰酸钾浓度变化1 mmol所消耗9 mg碳的假设在水溶性有机碳的测定中也是成立的。但是土壤中水溶性有机碳主要包括脂肪酸、芳香酸、氨基酸、单糖、低聚糖和低分子量的富里酸等，如果不同的土壤组成差异比较大的话，采用该方法就可能存在一定偏差。通过配对样品的t检验得知，高锰酸钾氧化比色法测定WSOC的值与TOC仪器法的测定结果不具有显著性差异，说明可以用高锰酸钾氧化比色法测定WSOC，虽然相对于TOC仪器法的测定结果较低，但是与TOC仪器法的测定结果有着良好的线性关系，乘以矫正系数1.28即为TOC仪器法的测定值。由于不同研究者采用土壤样品的类型和数量不同、土壤溶液的浸提方法不同，造成转换方程式也会不同，相应的矫正系数也会出现差别。尽管本研究的研究区域具有一定的代表性，土壤样品数量也较多，由于仍局限于某个区域不够系统化，因此需更多区域的土壤样品来进行检验，以不断修正转换方程式和参数。