猪圆环病毒Ⅱ型盐城株的全基因组克隆与序列分析

陶宏卫， 郭广富， 曹军平， 申建荣， 张晋川， 练国俊， 朱爱萍， 张佳浩， 朱金其

(1.江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏泰州 225300； 2.江苏泰州泰牧动物医院，江苏泰州 225300；3.江苏滨海鸿盛生猪饲养有限公司，江苏滨海 224500)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovims)，是迄今为止发现的最小的动物病毒之一。根据致病性、抗原性以及核酸序列的不同，将PCV分为PCV1和PCV2这2个血清型。PCV2感染猪群能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、猪呼吸道疾病综合症(porcine respiratory disease complex，PRDC)及怀孕母猪繁殖障碍(sow abortion and mortality syndrome，SAMS)等[1]。血清学和病原学调查证实，PCV2呈世界性分布，给养猪业造成巨大的经济损失[2-3]。PCV2基因组大小约1.7 kp，包括5个基因亚型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e[4]。

本研究通过盐城地区疑似发生PMWS的2个养猪场采集病料，PCR扩增PCV2全基因组，并进行序列测定和比较分析，旨在了解PCV2的遗传变异情况，为今后的深入研究和科学防控该病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症猪的腹股沟淋巴结、脾脏和肺脏等组织，于2015年11月采自盐城地区2个养猪场的2份病料。基因组DNA快速抽提试剂盒(动物)、TaqDNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2、2 000 bp DNA Ladder、pUCm-T载体及10×PCR buffer均为上海生工生物工程有限公司产品，6×DNA凝胶载入染料(Loading Dye)、内切酶PstⅠ等购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 引物的设计与合成

根据文献[5]，合成1对可扩增PCV2全基因组的引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列为：P1：5′-TGTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA-3′；P2：5′-GCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′。

1.3 病料中PCV2全基因组的PCR扩增

将采集的病猪脾脏、淋巴结和肺等组织混合，研磨研碎，按1 ∶5加入无菌含双抗的PBS溶液，混匀，-20 ℃反复冻融3次，4 ℃ 8 000 r/min离心7 min，取上清，用基因组DNA快速抽提试剂盒，按说明书上的操作方法提取组织病料DNA。以提取的组织病料DNA为模板进行PCR扩增，PCR采用 50 μL 反应体系：5 μL 10×buffer、TaqDNA聚合酶1 μL、模板DNA 3 μL、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 pmol/L 的上下游引物各1 μL，用灭菌超纯水补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸2 min，进行35个循环；最后72 ℃延伸 10 min。反应结束后用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳图谱，拍照记录结果并回收胶。

1.4 PCV2全基因组测序

将胶回收的PCR产物连接到pUCm-T载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取经PCR初步鉴定为阳性的白斑菌，扩大培养后提取质粒，进行重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定，筛选出阳性克隆。将鉴定为阳性克隆的菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.5 PCV2基因序列的比较分析

应用DNA Star和MEGA 5.2分析软件对扩增的PCV2全基因组和GenBank中的8株PCV2基因序列进行遗传进化分析。用于本研究分析的参考毒株基因组序列均来自于NCBI(表1)。

表1 各分离株信息

2 结果与分析

2.1 病料中PCV2全基因组的PCR扩增

以组织病料提取的DNA为模板，用P1和P2引物扩增PCV2全基因组，由图1可知，2份病料均呈阳性，其PCR扩增片段大小约1.7 kb，与预期的结果相符。将2个猪场检测到的PCV2分别命名为BH07株、BH11株。

2.2 重组质粒的鉴定

将胶回收的PCR产物连接到pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒。PCR鉴定重组质粒，结果为阳性(图2)；使用内切酶PstⅠ酶切鉴定重组质粒，结果呈阳性(图3)。

2.3 PCV2全基因核苷酸同源性比较

将鉴定为阳性克隆的重组质粒进行测序，测序发现BH07株和BH11株全长分别为1 767、1 766 bp。从NCBI上收录的毒株序列中选取8株PCV2基因序列，包含PCV2的5种基因亚型(PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e)的代表毒株和PCV1的代表株。运用DNA Star软件对其进行同源性分析，由表2可知，BH07株和BH11株与不同亚型的分离株同源性均较高，最高为99.0%，最低为73.3%，其中BH07株与PCV2d代表株AY181946的核苷酸同源性最高，为97.6%；BH11株与AY181946的核苷酸同源性最高，为97.8%；BH07株与BH11株的核苷酸同源性为98.1%。

表2 PCV2全基因核苷酸同源性比较

注：毒株各编号分别代表以下毒株：1为EU148503，2为EU148505，3为GU371908，4为BH11，5为BH07，6为AF055392，7为AF055394，8为AY181946，9为AY660574，10为EF524532。

2.4 PCV2全基因遗传进化分析

应用软件MEGA 5.2中的邻近归并法绘制遗传进化树，系统重复参考值设定为1 000次重复。从绘制的进化树(图4)中可见，PCV分成2个完全独立的大分支，其中8株PCV2构成1个大的分支，其他2株PCV1则组成另一独立的大分支。本研究获得的BH07株和BH11株属于8株PCV2中的组成部分，且与PCV2d代表株AY181946共同构成1个独立的小分支。由此可知，BH07株和BH11株PCV2均属于PCV2d基因亚型。

3 讨论

欧盟根据PCV2全基因组在进化树上遗传距离大小的不同将其分成PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d及PCV2e等5个基因亚型，其中PCV2e和PCV2a均属于传统分类方法中的PCV2a，PCV2c、PCV2d和PCV2b均属于传统分类方法中的PCV2b。Wang等对中国多个省份病料中的PCV2进行了分离鉴定及亚型区分，首次报道了PCV2d亚型在中国存在[6]。本次试验的2个毒株经过核苷酸同源性比较和遗传进化树的分析验证，最终确定BH07株和BH11株PCV2均属于PCV2d基因亚型。PCV2基因组全长为1 766～1 768 bp，本次测序结果BH07株和BH11株全长不一致，分别为1 767、1 766 bp，比较二者基因序列发现BH11株在824位缺失了1个碱基。这与曹东阳等报道的江苏盐城地区存在基因大小1 766 bp的PCV2d[7]是一致的。本试验对盐城地区2个猪圆环病毒病猪场的病料进行了PCV2全基因组克隆与序列分析，为今后进一步深入研究该病毒的生物学特性及开发有效的免疫制剂提供了科学的参考依据。