三七丹参片中人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的含量测定

黄跃伟

（贵州德良方药业股份有限公司 贵州 兴义 562409）

三七丹参片系由三七和丹参两味中药经提取加工制成的片剂，具有活血化瘀，理气止痛的功效，长期服用有预防和治疗冠心病、心绞痛的作用[1]。三七丹参片采取高效液相色谱法分别检测人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量，通过计算两成份总量来控制产品的含量[2]。为了进一步提高三七丹参片的质量标准，确保临床患者用药安全有效，对三七丹参片中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量测定进行研究，建立三七丹参片中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量测定方法。

1.仪器与试药

1.1 仪器

HP-1100高效液相自动进样色谱仪（德国：包括G1311A四元梯度泵、G1315A二极管阵列检测器、HP化学工作站），CQ-250超声波清洗器（上海船舶电子设备研究所）。

1.2 药物

人参皂苷Rg1对照品（供含量测定用，批号110703-200424，中国药品生物制品检定所），人参皂苷Rb1（供含量测定用，批号110704-200420，中国药品生物制品检定所），三七皂苷R1对照品（供含量测定用，批号110745-200313，中国药品生物制品检定所），乙腈（色谱纯），其它试剂均为分析纯。三七丹参片5批由贵州德良方药业股份有限公司生产。

2.方法与结果

2.1 对照品、供试品以及阴性对照溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.4mg、人参皂苷Rb10.4mg和三七皂苷R10.1mg的混合溶液，即得对照品溶液。取本品20片，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇25ml，密塞，称定重量，超声（功率250w，频率33kHz）处理30分钟，放冷，再称定重量，加70%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺三七阴性对照，按照“2.1”项供试品溶液制备方法制备缺三七阴性对照溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为 AgiLent HypersiL C18柱（4.0×250mm，5μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱（0～ 12分 钟：A为 9%，B为 81%；12～ 60分 钟：A为19%→36%，B为81%→64%），流速1ml/min，柱温25℃，检测波长为203nm，理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000。

2.3 专属性试验

按照拟定的色谱条件吸取对照品溶液、供试品溶液和缺三七的阴性对照溶液各10l，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明供试品色谱中，在与对照品色谱峰相应峰时处有色谱峰，且与相邻杂质峰充分分离；阴性对照无干扰，表明该方法专属性较好，见图1。

图1 对照品、供试品、阴性对照色谱表

2.4 线性关系

精密称取三七皂苷R1对照品11.62mg，置25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，为三七皂苷R1对照品储备液（每1ml 含三七皂苷R1 0.465mg）；精密称取人参皂苷Rg1对照品24.01mg、人参皂苷Rb1对照品20.82mg，精密吸取三七皂苷R1对照品储备液10ml，置同一25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得每1ml含人参皂苷Rg10.96mg、人参皂苷Rb10.833mg、三七皂苷R1 0.186mg 的混合对照品溶液。

分别精密吸取混合对照品溶液适量，加甲醇稀释得以下各成分浓度：

（1）人参皂苷Rg1：0.1152mg/ml、0.192mg/ml、0.2304mg/ml、0.384mg/ml、0.48mg/ml、0.96mg/ml。

（2） 人 参 皂 苷 Rb1：99.96μg/ml、166.6mg/ml、199.92μg/ml、333.2μg/ml、416.5μg/ml、833μg/ml。

（3） 三 七 皂 苷 R1：22.32μg/ml、 37.2μg/ml、44.64μg/ml、74.4μg/ml、93μg/ml、186μg/ml。

分别吸取10μl，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定对照品峰面积，将样品浓度与峰面积进行回归处理，分别绘制工作曲线，得线性回归方程为：人参皂苷Rg1，Y=3005X+16.97，R2=0.9995（Y为峰面积，X为进样浓度），进样浓度在0.1152～0.96mg/ml线性关系良好，人参皂苷Rb1，Y=2374.6X+76.907，R2=0.9996（Y为峰面积，X为进样浓度），进样浓度在99.96～833μg/ml线性关系良好，三七皂苷R1，Y=2.9385X-0.477，R2=0.9997（Y为峰面积，X为进样浓度），进样浓度在22.32～186μg/ml线性关系良好。

2.5 重复性试验

取本品20片，精密称定，研细，取0.25g，精密称定，照“2.1”项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，平行制备六个供试品溶液，分别精密吸取10μl，注入高效液相色谱仪，测定，结果显示，供试品取样量0.25g，人参皂苷Rg1平均含量为13.0714mg/片，RSD为0.51%，人参皂苷Rb1平均含量为11.1827mg/片，RSD为0.63%，三七皂苷R1平均含量为3.0378 mg/片，RSD为0.17，表明本方法重复性良好。

2.6 精密度试验

精密吸取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1混合对照品溶液10l（每1ml含人参皂苷Rg10.96mg、人参皂苷Rb10.833mg、三七皂苷R1 0.186mg），按上述色谱条件，重复进样5次，分别测定对照品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面积，结果显示，对照品溶液中人参皂苷Rg1平均峰面积为2860.2，RSD为1.27%，人参皂苷Rb1平均峰面积为2072.7，RSD为1.96%，三七皂苷R1平均峰面积545.6，RSD为1.84%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10l，按上述色谱条件，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定供试品溶液中各成分峰面积，结果显示，供试品溶液中人参皂苷Rg1平均峰面积为842.15，RSD为1.28%，人参皂苷Rb1平均峰面积为622.85，RSD为1.32%，三七皂苷R1平均峰面积187.88，RSD为1.54%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.8 回性率试验

取本品20片，精密称定，研细，取约0.125g，精密称定，置25ml容量瓶中，各精密加入一定体积的人参皂苷Rg1（0.4736mg/ml）、人参皂苷Rb1（0.5732mg/ml）、三七皂苷R1（0.3724mg/ml）对照品溶液，用70%甲醇定容至刻度，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加入70%甲醇补足减少的重量。摇匀，滤过，取适量用微孔滤膜（0.45μm）滤过，吸取10L续滤液注入液相色谱仪中进行含量测定，计算回收率，回收率（%）=（测出总量－样品含量）/对照品加入量×100%，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.9 制剂中含人参皂苷Rg10.4mg、人参皂苷Rb10.4mg和三七皂苷R1含量测定

随意抽取三七丹参片留样产品5批，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照拟定的含量测定方法进行检测，5批产品检测结果见表2。

表2 三七丹参片5批留样产品含量测定结果

从表中5批含量测定数据可知，平均含量为27.0514mg/片，拟定含量测定限度为：本品每片含三七以人参皂苷Rg1（C42H72O14）、人参皂苷Rb1（C54H92O23）和三七皂苷R1（C47H80O18）三者的总量计，不得少于21.5mg。

3.讨论

三七丹参片原质量标准含量测定，采用高效液相色谱法外标法分别检测人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量，通过计算两成份总量来控制产品的含量。

由于三七在处方中用药量较大，为了进一步提高三七丹参片的质量标准，结合《中国药典》2015年版一部三七项下采用了高效液相色谱法（梯度洗脱）测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[3]，因此，本试验我们以此条件为基础，对三七丹参片中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1含量测定进行实验研究，建立三七丹参片中人参皂苷Rg、人参皂苷Rb和三七皂苷R1的含量测定方法，以使质控标准更趋完善，更有效地控制了三七丹参片的质量。