阴离子交换高效液相色谱法测定婴幼儿食品与乳品中的核苷酸

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦公司)，配二极管阵列检测器；分析天平(感量为0.1 mg)。

核苷酸标准品CMP、AMP、UMP购自百灵威公司，GMP、IMP购自安谱公司，标准品纯度均大于98%；磷酸二氢钾(分析纯)、甲醇(色谱纯)直接使用；奶粉质控样品SRM1849a(简称1849a)购自美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)；婴幼儿配方食品来源于深圳市各大市场和超市。实验用水为Milli-Q去离子水(美国Millipore公司Milli-Q超纯水机制备)。

1.2 标准溶液的配制

用水配制质量浓度均为1.00 g/L的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP标准储备液，于4 ℃保存。然后配制5种核苷酸质量浓度分别为0.200、1.00、10.0、50.0、100、200 mg/L的系列标准工作液，用于线性关系考察。

1.3 样品前处理

样品前处理按GB 5413.40中的“5.1试样制备”进行。

1.3.1样品预处理含淀粉的试样：称取混合均匀的固体试样5 g(精确至0.1 mg)于100 mL锥形瓶中，加入约0.2 g淀粉酶，用20 mL热水(30～40 ℃)充分溶解，或称取混合均匀的液体试样约20 g(精确至1 mg)于100 mL锥形瓶中，加入约0.2 g淀粉酶摇匀，于(37±2) ℃培养箱内酶解30 min。取出冷却至室温。

不含淀粉的试样：取混合均匀的固体试样5 g(精确至0.1 mg)于100 mL锥形瓶中，加入20 mL热水(50～60 ℃)充分溶解，冷却至室温，或称取混合均匀的液体试样约20 g(精确至1 mg)于100 mL锥形瓶中。

1.3.2待测液的制备用醋酸将试样溶液调至pH 4.1，移入50 mL容量瓶中，用水定容，滤纸过滤，所得滤液用0.45 μm微膜过滤，备用。

1.4 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax SAX(4.6 mm×250 mm，5 μm)强阴离子交换色谱柱，流动相：A为甲醇、B为磷酸二氢钾水溶液(10 mmol/L，pH 4.5)；梯度洗脱：0～25.0 min，40%～100%B；25.0～25.1 min，100%～40%B；流速1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；进样体积10 μL。

图1 采用C18-T色谱柱分离核苷酸的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of nucleotides by C18-T column A：mixed standard solution；B：real sample

图2 采用SAX色谱柱分离核苷酸的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of nucleotides by SAX columnA：mixed standard solution；B：real sample；separation condition：“1.4”

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

考察了GB 5413.40推荐的C18-T色谱柱(SupelcosilTMLC-18-T，250 mm×4.6 mm，5 μm),以及Phenomenex Kinetex PFP(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax NH2(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SAX(4.6 mm×250 mm，5 μm)等其它类型的色谱柱对核苷酸的分离效果。结果表明，C18-T和SAX色谱柱对5种核苷酸标准品的分离较好。但在实际样品分析时，由于CMP在C18-T反相色谱柱上的保留较弱，出峰较早，定量时有基质干扰(见图1)。因此，本研究最终采用SAX色谱柱进行分离分析。

尽管离子色谱法是分析阴、阳离子的高效分离测试技术[14]，且核苷酸在水溶液中呈离子状态，可应用离子色谱的作用原理进行分离。但实际工作中离子色谱仪的应用不如高效液相色谱仪广泛，故本文选用离子色谱原理进行分离的离子交换色谱柱。Zorbax SAX色谱柱因硅胶上键合了季铵强阴离子交换基团，故具有离子交换作用和反相吸附作用。本研究结果表明，阴离子交换高效液相色谱法分离核苷酸时，各待测物在实验条件下均有较好的保留，可实现基线分离，且标液和样品检测时5种核苷酸均无干扰，定量准确(见图2)。

2.2 流动相条件的优化

离子交换色谱的流动相需要合适的缓冲溶液，本实验选择离子交换色谱法的常用淋洗剂——KH2PO4水溶液作为流动相。由于核苷酸在强酸性及碱性条件下不稳定，在pH值较低的强酸性条件下，核苷酸的解离被抑制；而pH值升高至弱酸性条件时，核苷酸解离为阴离子，与SAX固定相作用力增强，保留增加。通过对pH值(pH 3.0、4.5)的优化比较，选择分离和峰形较好的10 mmol/L KH2PO4(pH 4.5)水溶液作为缓冲溶液。

在离子交换色谱中存在3种电离平衡，分别为样品组分的电离平衡、流动相中缓冲溶液的电离平衡、柱上离子交换基团的电离平衡。色谱柱保留行为的变化、流动相组成会综合影响上述电离平衡[15]。因此，在流动相条件优化时，设计了缓冲液梯度增加(见“1.4”)和缓冲液梯度减少(0～23.0 min，100%～35%B；23.0～23.1 min，35%～100%B)两种方式，流速均为1 mL/min。实验表明，两种梯度变化方式下，5种核苷酸均可实现基线分离。在不同的洗脱条件下，各组分之间的出峰顺序和分离度发生了改变，实验通过标准物质对各分析物进行定性。由于缓冲液梯度增加(见“1.4”)方式的分离度更好，保留时间更稳定，色谱柱的使用寿命更长，因此确定为色谱条件。

2.3 线性范围、检出限与定量下限

将核苷酸系列标准工作液按优化条件进样，以标准系列溶液的质量浓度为横坐标(x，mg/L)，相应的峰面积为纵坐标(y)做线性回归方程；分别以信噪比(S/N)为3和10计算检出限和定量下限，结果见表1。5种核苷酸的线性相关性较好，相关系数(r)为0.999 8～1.000 0，线性范围均为0.200～200 mg/L。而且，本改良方法较GB 5413.40的定量下限(CMP、AMP、UMP、GMP、IMP的定量下限分别为3.3、5.0、5.0、5.0、6.7 mg/kg)更低。

表1 5种核苷酸的线性方程、线性范围、相关系数、检出限与定量下限Table 1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r)，LODs and LOQs of five nucleotides

2.4 回收率与相对标准偏差

取空白婴幼儿配方奶粉5 g，分别添加低、中、高3个水平的混合标准工作液，每个加标水平做6个平行样品，回收率及相对标准偏差见表2。结果表明，本方法的回收率为95.5%～108%，相对标准偏差(RSD)为1.0%～3.2%，准确度和精密度符合GB/T 27404-2008 F.1和F.3的要求[16]。

表2 5种核苷酸的加标回收率与相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of five nucleotides spiked in samples(n=6)

2.5 实际样品分析

本研究在2017年完成了深圳市100多批次婴幼儿配方食品中核苷酸的测定，包含雅培、美赞臣、美素佳儿、惠氏、爱他美、诺贝能、太子乐、合生元等品牌。同时，测定了有证质控样品1849a。实验结果表明，1849a质控样品中的5种核苷酸含量均在参考值范围内，实际奶粉样品的检测均无基质干扰，部分样品的检测结果见表3。

表3 1849a质控奶粉和10个婴幼儿配方奶粉中核苷酸的含量

Table 3 Contents of nucleotides in 1849a quality control milk powder and 10 infant formula milk powder (mg/100g)

*no detected

3 结论

本研究建立了阴离子交换高效液相色谱测定婴幼儿食品和乳品中核苷酸含量的方法。该方法样品前处理依据GB 5413.40，处理过程简单；在高效液相色谱分离阶段，阴离子交换色谱柱对核苷酸类物质有较强的保留，5种核苷酸分离度好，检出限低，定量准确度高。该改良方法很好地解决了高效液相色谱法测定婴幼儿食品和乳品中核苷酸含量时易被杂质干扰的问题，完善了GB 5413.40的参考色谱条件，可为婴幼儿食品和乳品中核苷酸的监督监管工作提供技术支持。