布鲁氏菌MLVA-15分型方法的建立

王 勋，米吉提·莫合他尔汗，孙明军，狄栋栋，许 芳，贾舒安，颜成旭，李金平，范伟兴，曾巧英*

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州730070；2.新疆动物卫生监督所，乌鲁木齐830000；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032)

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种危害严重的人兽共患传染病。在目前已知的6个经典布鲁氏菌种中[1]，对我国畜牧业造成重大危害并能引起人致病的主要为羊种布鲁氏菌(B.melitensis)[2]，其次是牛种布鲁氏菌(B.abortus)和猪种布鲁氏菌(B.suis)[3]。而羊种布鲁氏菌三个生物型(1、2、3型)中，最常见的是生物3型，占整个羊种分离菌株的80%以上。布鲁氏菌在遗传上高度保守，而我国流行菌株的种型相对单一，因而，建立一个分辨力高的布鲁氏菌鉴别方法对布病流行病学调查尤其是病原追溯是非常必要的。

由于传统的布鲁氏菌种型鉴定方法过程繁琐、人员感染风险较高，因而以核酸分子为基础的基因型分析方法越来越受到重视。多位点可变数目串联重复序列分析(Multi-locus VNTR Assay，MLVA)和多位点序列分析(multi-locus sequence analysis，MLSA)是目前国际上主要的布鲁氏菌分子分型方法。基于16个可变数目串联重复序列(Variable-Number of Tandem-Repeats，VNTR)位点的MLVA分型方法(MLVA-16)具有较高的分辨力且最为常用[3-4]，可用于地域关系比较远的布鲁氏菌分离株的鉴别和遗传关系分析，但对于遗传关系较近的菌株区分能力较弱；包含21个看家基因的MLSA分型方法(BruMLSA21)对不同种的布鲁氏菌菌株具有很好的区分能力[5-7]，但对于同一种型的布鲁氏菌的区分能力还是很低。我国布鲁氏菌流行菌株的种型单一且遗传同源性较高，MLVA-16和BruMLSA21的大部分位点在我国分离菌株中没有多态性或者仅呈现有限的多态性[2,8]，对菌株区分能力较弱，无法满足布病流调中对病原追溯的需求。因而，有必要建立一个分辨率高的、适合我国布鲁氏菌遗传特性的分型方法，为我国布病分子流行病学调查和分析菌株间遗传关系提供支持。

1 材料与方法

1.1 VNTR位点选择和引物设计 根据已有文献[3,9]，对95个已知布鲁氏菌VNTR位点进行重新筛选和评价。VNTR筛选依据包括：(1)所有位点在牛种、羊种和猪种布鲁氏菌参考菌株(B.melitensis16M,B.abortus2308和B.suis1330)中都存在；(2)在同一PCR反应条件下，所有VNTR位点都能有效扩增；(3)VNTR位点在布鲁氏菌基因组中均匀分布；(4)为了方便检测，扩增片短长度在100～ 600 bp 之间，特异性高，无其他非特异性带。布鲁氏菌参考菌株的基因组由中国动物卫生与流行病学中心提供；PCR有关试剂购自宝生物工程有限公司(Takara)。

1.2 与传统的MLVA-16分型方法的比较 利用我国分离的51株羊种布鲁氏菌分离菌株(中国动物卫生与流行病学中心人兽共患病监测室提供)对不同MLVA分型方法进行对比评价。这些菌株分别来自我国新疆、山东、甘肃、河南、河北五省的不同地市，分离时间为2010-2016年，具有一定的代表性，分离方法见文献[6]。通过PCR和毛细管电泳方法来确定各菌株每个VNTR位点扩增产物的分子量，根据分子量大小计算VNTR位点的重复单元数。用Hunter-Gaston Diversity(HGDI)指数对每个VNTR位点的多态性进行分析(http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl)。应用BioNumerics 7.6软件对菌株之间的亲缘关系进行聚类分析。细菌基因组提取试剂盒由宝生物工程有限公司(Takara)提供。

1.3 与BruMLSA21分型的比较 利用上述51株羊种布鲁氏菌分离菌株，参照Sun M J方法[8]对21个基因位点进行PCR扩增和测序。测序结果与BrucellaMLST数据库进行比对(https://pubmlst.org/Brucella/)，对出现的新等位基因给定一个独特的数值，在21个基因位点上只要有一个新的等位基因则定义为一个新的序列型。21个位点的序列组装连接后，利用MEGA 5.1软件绘制系统进化树。

2 结果与分析

2.1 MLVA分型方法的优化 通过对布鲁氏菌VNTR位点进行筛选和评价，其中47个VNTR位点符合要求，删除多态性位点相近的位点，最终选择了15个VNTR位点(I号染色体10个，Ⅱ号染色体5个)，作为一个新的MLVA分型方法-MLVA-15，各VNTR位点的引物、重复片段长度、PCR产物大小与重复片段拷贝数等信息见表1。与传统的MLVA-16分型方法相比，MLVA-15分型方法保留了其中8个VNTR位点(Bruce04、Bruce09、Bruce16、Bruce30、Bruce42、Bruce43、Bruce45 和Bruce55)，另外又包括了7个未被使用的位点(Bruce13、Bruce15、Bruce17、Bruce24、Bruce72、BruceVNTR1和BruceVNTR25)。PCR反应条件如下：95 ℃ 5 min预变性；然后进行30个循环的扩增(95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 MLVA-15 VNTR位点信息表Tab 1 Information of VNTRs in MLVA-15

2.2 MLVA-15与MLVA-16分型方法的比较 对51株我国羊种布鲁氏菌分离菌株MLVA-15 VNTR位点的多态性分析结果显示，除了Bruce45和Bruce55 2个VNTR位点，其他所有位点均呈现不同程度的多态性(HGDI=0.077～0.887)(表2)。其中，Bruce04、Bruce24、Bruce30和BruceVNTR1 4个位点的多态性最高(HGDI=0.718～0.887)，其余9个位点具有中等或较低的多态性(HGDI=0.077～0.645)。MLVA-15分型方法对菌株的区分能力明显提高，51株布鲁氏菌分为51个基因型，对菌株的鉴别效率达到100%(图1)。MLVA-16分型方法仅鉴定出28个基因型，对菌株的区分效率为55%，显著低于MLVA-15(图2)。对于菌株之间的遗传关系分析，MLVA-15分型方法与MLVA-16分型方法获得的聚类结果基本一致，具有相同MLVA-16基因型的5个菌株(Bruxj20、Bruxj35、Bruxj99、GS1683和GS1692)在MLVA-15聚类图上也聚为一簇(图1、图2)，表明MLVA-15分型方法不会对以往MLVA-16分析遗传关系的结果产生较大的改变。

表2 MLVA-15各VNTR位点在51株布鲁氏菌中的多态性Tab 2 Genetic diversity of MLVA-15 VNTRs in 51 B. melitensis isolates

2.3 MLVA-15与BruMLSA21分型方法的比较 对21个基因的测序结果表明，51株羊种布鲁氏菌菌株共发现4个序列型(Sequence type, ST)，分别为ST8、ST137、ST138和ST139。其中37株属于ST8，ST139菌株也比较常见(12株)，ST138和ST137仅有1株。4个序列型之间的差异很小，是由三个基因的单核苷酸突变引起的，表明我国羊种布鲁氏菌流行株在遗传上是十分保守的(表3)。

表3 51株羊种布鲁氏菌流行株序列型分析Tab 3 ST designation of 51 B.melitensis strains

3 讨论与小结

以MLVA和MLSA为主的分子分型方法在分析布鲁氏菌变异程度和遗传关系上起到重要作用。MLVA利用布鲁氏菌基因组中的VNTR位点来研究布鲁氏菌遗传多态性，因为不同拷贝数的重复序列经常出现在不同种或同一个种的不同株、型之间。其中，MLVA-16分型方法最为常用[10-11]。该法包括16个VNTR位点，分为Panel 1和Panel 2两组。Panel1的8个位点的多态性较低，仅用于遗传关系较远的菌株的鉴别，尤其是布鲁氏菌在种水平上的鉴别。Panel2的8个位点具有中等或较高的遗传多态性，适用于遗传关系较近的同种(或生物型)菌株的鉴别[4,9]。这种VNTR位点组合可以分析流行菌株之间的差异和遗传关系，但对国内当前布鲁氏菌流行菌株的鉴别能力略显不足。对于国内羊种布鲁氏菌，16个VNTR位点仅有3个位点(Bruce04、Bruce16、Bruce30)具有较高多态性，1个位点(Bruce43)具有中等多态性，其余12个位点的多态性很低或没有任何多态性。研究建立的MLVA-15方法减少了MLVA-16中8个不具有多态性的位点，增加了7个多态性较高的位点，提高了对布鲁氏菌流行菌株的鉴别能力，可以满足布病流行病学调查中对传染源和传播途径精确追溯的需求。

右侧数据依次为菌株分离地点、名称、生物型和分离时间Right columns represents isolation location, names, biotype and isolation date图1 51株我国羊种布鲁氏菌MLVA-15聚类分析结果Fig 1 MLVA-15 cluster analysis on 51 B.melitenis isolates

右侧数据依次为菌株分离地点、名称、生物型和分离时间Right columns represents isolation location, names, biotype and isolation date图2 51株我国羊种布鲁氏菌MLVA-16聚类分析结果Fig 2 MLVA-16 cluster analysis on 51 B.melitenis isolates

BruMLSA21分型是利用布鲁氏菌21个看家基因的单核苷酸多态性来区分菌株的方法，核苷酸序列变异也可反映菌株之间的进化关系。BruMLSA21分析表明，我国大部分羊种布鲁氏菌流行株属于ST8，同时还存在一些不常见的序列型。BruMLSA21与BruMLSA9相比(仅发现一个基因型ST8)[7]，对菌株区别能力大有提高，但与传统的MLVA-16和新建立的MLVA-15分型方法相比，对菌株的分辨能力还是很低。尽管增加基因个数或长度可以增加其分辨力，但同时也增加了测序成本，不适合推广使用。因为有全球化的数据库(https://pubmlst.org/)，便于各国分离菌株之间的比较，BruMLSA21在分析各国布鲁氏菌菌株的遗传多态性以及进化分析方面仍具有参考意义[8,12]。

除了MLVA和BruMLSA21，基于全基因组测序的SNP分型方法(WGS-SNPs based typing)对布鲁氏菌菌株具有极高的辨别能力，也开始用于我国布鲁氏菌流行菌株的遗传多态性和进化关系分析[13]，但是由于检测成本较高，该方法目前使用较少。因而在未来的一段时期，基于不同VNTR位点组合的MLVA分型技术仍将在布鲁氏菌的分离鉴定及遗传关系分析方面发挥重要作用。