高效液相色谱法同时测定鼠曲草中槲皮素与木犀草素的含量＊

许赞杉，林小华

（厦门医学院药学系 厦门 361023）

鼠曲草为菊科鼠曲草属植物鼠曲草（Gnaphalium affineD.Don）的干燥全草，又名清明菜、佛耳草、追骨风、土茵陈等，主要分布在亚洲地区，以我国和朝鲜、菲律宾等地多见[1]。其性平，味甘，具有化痰止咳、祛风平喘、除湿止痹之功效，主治感冒咳嗽、支气管炎、哮喘、高血压、蚕豆病、风湿腰腿痛等[2-3]。另一方面，鼠曲草自古以来就一直作为野菜而被人们食用[4]。有研究表明，鼠曲草中含有二萜类、生物碱和黄酮等化合物，其中黄酮类为主要活性成分[5-7]。现代药理研究发现黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝作用，具有保护心脑血管系统和抗病毒等广泛的生理活性[8-9]。目前关于鼠曲草化学成分含量测定的研究报道较少，仅见槲皮素的测定[10]，为深入挖掘我国宝贵的中药资源，本实验采用HPLC法，同时测定鼠曲草中槲皮素和木犀草素含量，该方法简便准确，可以用来更好地控制和完善鼠曲草药材的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国Waters e2695高效液相色谱仪（包括四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、2998二极管阵列检测器），Empower色谱工作站；SY25-1200型超声波清洗器（张家港市三友超音设备厂）；RT-04型多功能粉碎机（台湾鸿翔药材器械厂）；XPE105型电子太平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；DHG型鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH-S型水浴锅（上海君竺仪器制造有限公司）；0.45 μm微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

1.2 试药

槲皮素对照品（含量98%，批号C20J6Y1722，上海源叶生物科技有限公司）；木犀草素对照品（含量98%，批号Y01D656815，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，Tedia公司）；磷酸（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水（自制）；其他试剂均为分析纯。鼠曲草采摘于厦门汀溪水库、东岭水库和坂头水库，经厦门医学院中药教研室向云亚老师鉴定为菊科植物黄花鼠曲草的全草。

图1 对照品混合溶液色谱图

图2 供试品溶液色谱图

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18(2)（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（42:58）；检测波长：360 nm；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：30℃。在此色谱条件下，槲皮素和木犀草素均达到基线分离（R＞1.5），理论塔板数均不低于4 000，分离色谱见图1、图2。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素与木犀草素对照品各17.94 mg、6.47 mg，分别置10 mL量瓶中，各加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含1794 μg的槲皮素对照品储备液和每1 mL含647 μg的木犀草素对照品储备液。精密吸取上述2种对照品储备液各2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取鼠曲草粉末2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下的混合对照品溶液各0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成不同浓度的混合对照品溶液。取上述对照品混合溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样并测定，以质量浓度（μg·mL-1）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得槲皮素的回归方程为Y=664 19X+187 63（R2=0.999 6），木犀草素的回归方程为Y=762 59X+5 987（R2=0.999 4），表明槲皮素质量浓度在3.588-35.880 μg·mL-1（R2=0.999 6）范围内线性关系良好，木犀草素质量浓度在1.294-12.940 μg·mL-1（R2=0.999 4）范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验

精密吸取含槲皮素 21.528 μg·mL-1、木犀草素7.764 μg·mL-1的混合对照品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，计算其RSD。结果槲皮素、木犀草素峰面积的RSD分别为1.62%(n=6)、2.46%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

取按“2.2.2”项下制备条件制成的供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算其RSD。结果槲皮素、木犀草素峰面积的RSD分别为0.71%(n=6)、0.78%(n=6)，结果表明槲皮素和木犀草素的量均未发生明显的改变，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 重复性实验

精密称取同一鼠曲草样品粉末6份，每份约2 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算其RSD。结果槲皮素、木犀草素峰面积的RSD分别为1.38%(n=6)、1.15%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的鼠曲草样品粉末6份，每份约1 g，分别精密加入一定量的槲皮素和木犀草素对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，计算加样回收率，测得量带入“2.3.1”项下线性方程中，显示在线性范围内，结果见表1。

2.4 样品含量测定

精密称取3个不同产地的鼠曲草药材粉末各2 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，用外标法计算各样品中槲皮素和木犀草素的含有量，结果见表2。

3 讨论

3.1 流速的选择

本实验分别在0.8、0.9、1.0mL·min-13个流速下对样品进行分析，结果显示在流速为1.0 mL·min-1时，槲皮素和木犀草素的分离效果较佳，故选取此流速为最佳流速。

3.2 柱温的选择

我们考察了25、30、35℃3个柱温，在其他色谱条件相同的情况下进样分析，考察基线、峰形、出峰时间等参数，以确定最合适的柱温。结果显示柱温在30℃时，槲皮素和木犀草素的分离效果较佳，均能够达到基线分离，故选此柱温为最佳柱温。

3.3 色谱柱的选择

本实验选用了不同色谱柱进行比较：Agilent SBC18（4.6 mm×150 mm,5 μm)、Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm)以及Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm)。结果显示Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱响应值最好，样品各组分分离度好，故选用其作为本实验的色谱柱。

3.4 检测波长的选择

本实验采用二极管阵列检测器在190-400 nm波长进行扫描，结果发现槲皮素在254 nm和364 nm处有最大紫外吸收，木犀草素在253 nm和350 nm处有最大紫外吸收（见图3、图4）。因此我们考察了不同吸收波长（254 nm、350 nm、360 nm）的吸收图谱，发现在360 nm处两者均有较强吸收并且干扰很少，图谱特征性强，故选取360 nm作为本实验的检测波长。

3.5 流动相的选择

根据文献[11-12]，对比考察了乙腈-0.1%乙酸溶液（25∶75）、甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）、甲醇-0.4%磷酸溶液（42∶58）3种流动相，并考察了梯度洗脱模式，观察样品中槲皮素和木犀草素的分离情况。结果表明，选择甲醇-0.4%磷酸溶液（42∶58）为流动相时槲皮素和木犀草素的响应值好，峰形良好，理论塔板数、分离度、拖尾因子等均符合要求。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

表2 样品含量测定结果（n=3）

图3 槲皮素紫外吸收光谱图

图4 木犀草素紫外吸收光谱图

3.6 提取方法的选择

本实验考察了直接超声提取和石油醚索氏提取后超声提取两种方法，结果表明两种方法测得的含量基本无差异，故选择直接超声提取法；提取溶剂的选择我们比较了不同浓度的甲醇（60%甲醇、75%甲醇、80%甲醇）和不同浓度的乙醇（60%乙醇、75%乙醇、80%乙醇）的提取效率，结果表明用60%乙醇提取效果最好；同时考察了超声提取15 min、30 min和45 min，结果表明超声提取15 min未能提取完全，而超声提取30 min与 45 min基本无差异，故选择超声提取30 min的提取方法。根据实验结果最终确定样品的提取方法为采用60%乙醇超声提取30 min。

3.7 不同产地的鼠曲草中槲皮素和木犀草素的比较

由表2可以看出，不同产地的鼠曲草中槲皮素和木犀草素的含量不同，槲皮素在0.39-0.58 mg·g-1之间，木犀草素在0.17-0.27 mg·g-1之间，有一定的波动。二者均以汀溪水库为最高，坂头水库次之，东岭水库最低，这可能与鼠曲草的产地环境、气候温度、生长方式、采摘时间等因素有密切关系。因此，从黄酮类成分的资源利用角度来看，汀溪水库的鼠曲草质量最好，故建议在以鼠曲草作为药源时应考虑同种药材不同产地的含量差异。

综上，该方法简便快速、准确可靠、重现、精密度、稳定性、回收率都较好，可以用来更好地控制和完善鼠曲草药材的质量标准。