Aglaroxin C对肝癌细胞体内外生长的抑制作用

肖雪珍，袁东方，辛丹丹1,，齐 攀，冯跃庆，周 勇，岳爱民，杨留勤，王天翼

(1.新乡医学院，河南 新乡 453003;2.新乡市中心医院头颈乳腺科，河南 新乡 453000；3.新乡市中心医院放疗科，河南 新乡 453000；4.新乡市中心医院普瘤二科，河南 新乡 453000；5.新乡市中心医院肿瘤科，河南 新乡 453000)

肝癌是世界上最常见的致死性恶性肿瘤之一[1-3]。2017年中国癌症年报显示，我国肝癌发病率居恶性肿瘤的第3位，病死率仅次于肺癌，位居第2位[4]。临床上大多数肝癌患者确诊时已为晚期，通常预后不佳，5 a生存率约为10%[5]。楝酰胺是KING等[6]1982年从楝属植物Aglaiaelliptifolia中分离得到的一种环戊烷苯并呋喃类化合物，并发现楝酰胺可以增加P388淋巴细胞白血病荷瘤小鼠的中位生存期。随后，LEE等[7]研究发现，楝酰胺衍生物可以抑制人乳腺癌细胞在裸鼠体内的生长。国内关于楝酰胺及其衍生物的研究较少，故本研究初步探讨楝酰胺衍生物Aglaroxin C对人肝癌细胞HepG2体外增殖的影响及其对H22肝癌移植瘤小鼠的体内抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1细胞及动物来源鼠肝癌细胞株H22由新乡医学院肿瘤逆转分子实验室提供；人肝癌细胞株HepG2由新乡医学院代谢与精神神经疾病实验室提供；雄性Balb/c普通小鼠，5周龄，体质量18～21 g，购自北京维通利华实验动物中心，合格证号:SCXK(京) 2016-0011，饲养于河南省组织再生重点实验室动物室，实验过程中自由饮食、水。

1.2主要试剂及仪器顺铂(云南植物药业有限公司，国药准字H53021740)，Aglaroxin C(美国波士顿大学John A.PJ教授团队合成)，Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培养基购自美国Corning公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，实验用青链霉素混合液(×100)、2.5 g·L-1胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)均购自北京索莱宝科技有限公司，细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)购自日本同仁公司，二甲基亚飒(dimethylsulfoxide，DMSO)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；倒置显微镜购自日本Nikon公司，MD SpectraMax i3酶标仪购自美国Thermo Labysyterms公司，细胞培养瓶、96孔培养板购自美国Corning公司。

1.3细胞培养人肝癌细胞HepG2、鼠肝癌细胞H22均用RPMI-1640培养基培养，在细胞培养液中加入体积分数10%胎牛血清及体积分数1%青链霉素混合液，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱中传代培养，收集对数生长期细胞备用。

1.4CCK-8检测AglaroxinC对肝癌细胞HepG2增殖的影响取对数生长期人肝癌细胞HepG2常规消化后，按每孔100 μL(约3×103个细胞)接种于96孔培养板中，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱中培养12 h使其贴壁生长。将细胞分为1、10、100 nmol·L-1及1、10、100 μmol·L-1Aglaroxin C组。不同浓度Aglaroxin C组每孔分别加入1、10、100 nmol·L-1及1、10、100 μmol·L-1Aglaroxin C 100 μL，另设调零孔和对照孔，调零孔仅加培养基，对照孔不加任何药物。每个浓度设4个复孔，加药后将96孔培养板置于37 ℃、饱和湿度、含体积分数5%CO2培养箱中培养24、48、72 h，避光每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养箱孵育 2 h，用自动酶标仪检测各孔450 nm处吸光度值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-加药组吸光度值/对照组吸光度值)×100%，并计算Aglaroxin C的半数抑制浓度(50% inhibiting concentration，IC50)。

1.5小鼠皮下移植瘤模型的建立及用药取对数生长期鼠肝癌细胞H22，调整细胞密度至2.0×1010L-1。将25只Balb/c小鼠随机分为尾静脉对照组、尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组、瘤内对照组、瘤内0.05 mg Aglaroxin C组、瘤内0.10 mg Aglaroxin C组，每组5只。乙醇消毒小鼠左腋下皮肤，5组小鼠均于左腋皮下注射0.1 mL细胞悬液+0.1 mL生理盐水，保证无液体渗出。接种后48 h，小鼠左腋下形成皮下瘤后开始给药，根据预实验结果确定小鼠给药剂量。尾静脉对照组、尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组小鼠分别通过尾静脉注射生理盐水0.2 mL、0.50 g·L-1Aglaroxin C(0.10 mg Aglaroxin C溶于0.2 mL生理盐水中)0.2 mL；瘤内对照组、瘤内0.05 mg Aglaroxin C组、瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠分别瘤内多点注射生理盐水0.2 mL、0.25 g·L-1Aglaroxin C 0.2 mL、0.50 g·L-1Aglaroxin C 0.2 mL；隔日1次，共4次。给药期间采用游标卡尺测量小鼠肿瘤体积，肿瘤体积=肿瘤长径×肿瘤短径2/2[8-10]；末次给药后24 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，取腋下瘤组织，测质量并计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(1-给药组肿瘤质量/对照组肿瘤质量)×100%。取部分肿瘤组织石蜡包埋固定，切片，行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色，显微镜下观察肿瘤组织的病理变化。

2 结果

2.1AglaroxinC对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用结果见表1。不同浓度Aglaroxin C干预人肝癌细胞HepG2 24、48、72 h后，同一时间点人肝癌细胞HepG2的增殖抑制率随Aglaroxin C浓度的增加而增加，差异有统计学意义(F24 h=175.64，F48 h=37.36，F72 h=36.35；P<0.05)；Aglaroxin C干预人肝癌细胞HepG2 24、48、72 h的IC50分别为73、25、82 nmol·L-1。

2.2AglaroxinC对H22肝癌移植瘤小鼠肿瘤体积的影响结果见表2。给药干预2～8 d，尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤体积小于尾静脉对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；瘤内0.05 mg Aglaroxin C组、瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤体积均小于瘤内对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；瘤内0.05 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤体积与尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组比较差异无统计学意义(P>0.05)，瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤体积小于尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组，差异有统计学意义(P<0.05)。给药干预2～4 d，瘤内0.05 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤体积与瘤内0.10 mg Aglaroxin C组比较差异无统计学意义(P>0.05)；给药干预5～8 d，瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤体积小于瘤内0.05 mg Aglaroxin C组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组小鼠肿瘤体积的比较

注：与尾静脉对照组比较aP<0.05；与瘤内对照组比较bP<0.05；与尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组比较cP<0.05；与瘤内0.05 mg Aglaroxin C组比较dP<0.05。

2.3AglaroxinC对H22肝癌移植瘤小鼠的肿瘤质量及肿瘤抑制率的影响结果见表3。尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤质量明显小于尾静脉对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；瘤内0.05 mg Aglaroxin C组、瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤质量均小于瘤内对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。瘤内0.05 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤质量与尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组比较差异无统计学意义(P>0.05)，瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤质量小于尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组和瘤内0.05 mg Aglaroxin C组，差异有统计学意义(P<0.05)。瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤抑瘤率高于尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组和瘤内0.05 mg Aglaroxin C组，差异有统计学意义(P<0.05)；瘤内0.05 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤抑瘤率与尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组小鼠肿瘤质量及肿瘤抑制率比较

注：与尾静脉对照组比较aP<0.05；与瘤内对照组比较bP<0.05；与尾静脉0.10 mg组比较cP<0.05；与瘤内0.05 mg Aglaroxin C组比较dP<0.05；“-”无数据。

2.4AglaroxinC对H22肝癌移植瘤小鼠肿瘤组织的影响结果见图1。显微镜下可见，尾静脉对照组和瘤内对照组小鼠肿瘤细胞增殖数量多且分布密集，核大深染，排列紊乱且大小形态多样；尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组、瘤内0.05 mg Aglaroxin C组和瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤组织可见不同程度的坏死区，肿瘤细胞散在分布，核固缩，其中瘤内0.10 mg Aglaroxin C组小鼠肿瘤组织坏死程度最明显。

A：尾静脉对照组；B：尾静脉0.10 mg Aglaroxin C组；C：瘤内对照组；D：瘤内0.05 mg Aglaroxin C组；E：瘤内0.10 mg Aglaroxin C组。

3 讨论

原发性肝癌起病隐匿，恶性程度高，侵袭性强，进展迅速，确诊时多数已为晚期，失去了手术治疗机会。目前，肝动脉栓塞化学治疗(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)已成为无手术指征中晚期肝癌患者的首选治疗方法[11]，但是，由于TACE术后患者免疫功能下降，易导致肿瘤的复发及转移；近年来，分子靶向药物索拉菲尼被美国食品药品管理局批准为晚期肝癌治疗的一线药物，但索拉菲尼口服生物利用度低(8.43%)、毒副作用较多且价格昂贵，使其临床应用受到限制[5]。因此，寻找新的、疗效更好的治疗肝癌的生物靶向药物正备受关注。

楝属植物因产生各种独特的次生代谢产物而被人们所关注，包括cyclopenta[b]-benzofurane methyl rocaglate、Aglaiastatin、Aglaroxin C和cyclopenta[b,c]benzopyran (aglain) ponapensin。已有研究报道，这些代谢产物及其衍生的合成类似物具有抗肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的活性[12-13]。Rohinitib通过抑制热休克转录因子1活性和葡萄糖的摄取而发挥较强的抗肿瘤作用[14]，STONE等[12]研究发现，天然楝酰胺衍生物Aglaroxin C具有和RHT类似的抗肿瘤作用。LIU等[15]研究表明，人工合成楝酰胺衍生物Aglaroxin C可以显著改善丙型病毒性肝炎患者的治疗效能和治疗指数，该研究还发现此类衍生物可联合抗丙型肝炎病毒药物治疗丙型肝炎病毒感染，并且与其具有潜在的协同效应，在丙型肝炎合并肝癌患者中效果更明显。

本研究结果显示，不同浓度Aglaroxin C干预人肝癌细胞HepG2 24、48、72 h后，同一时间点人肝癌细胞HepG2的增殖抑制率随Aglaroxin C浓度的增加而增加；Aglaroxin C作用人肝癌细胞HepG2 24、48、72 h 的IC50分别为73、25、82 nmol·L-1。有研究表明，顺铂对人肝癌细胞HepG2的IC50为5～10 μmol·L-1[16]。Aglaroxin C体外抗肝癌的IC50明显低于顺铂，较小剂量的Aglaroxin C即可达到抑制肿瘤的效果。

动物体内实验使肿瘤细胞的生长环境更接近于临床实际[17]，因此，本课题组设计了小鼠移植瘤体内实验进一步探讨Aglaroxin C在体内的抗肿瘤作用。移植瘤小鼠模型是抗肿瘤实验应用较广的肿瘤模型，造模技术成熟，模型稳定性好，可较好反映药物在体内的抗肿瘤作用，与同类实验结果相比具有可比性。本研究体内实验结果显示，Aglaroxin C可以显著延缓并抑制体内肿瘤的生长，此外，同剂量的Aglaroxin C干预小鼠后，瘤内给药组小鼠移植瘤体积及肿瘤质量明显小于尾静脉给药组；提示瘤内给药疗效优于尾静脉给药。CHOWDHURY等[18]研究显示，楝酰胺及相关衍生物主要是通过抑制RNA解旋酶eIF4a而抑制翻译起始的抗癌化合物。但关于楝酰胺衍生物Aglaroxin C体内外抗肿瘤作用的分子机制目前尚不明确，有待进一步深入研究。