伏立诺他对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

梁冠盈 迟秋君 李晓梅

卵巢癌是女性三大恶性肿瘤之一，其发病隐匿和侵袭性强等特点使卵巢癌成为妇科恶性肿瘤之首位[1]。卵巢癌主要以手术治疗为主，配合放疗和化疗等，卵巢癌的复发率较高，复发后再次化疗极易产生耐药性，导致化疗失败，并且卵巢癌的五年生存率极低[2-4]。

伏立诺他是一种去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor，HDACI)，可以特异性的干扰去乙酰化酶的活性，该酶能够催化组蛋白和转录因子的酪氨酸残基去乙酰化。伏立诺他在2006年被美国FDA批准为治疗加重、持续和复发或用2种全身性药物治疗后无效的外周皮肤T细胞淋巴瘤。近年来随着研究的不断深入，发现伏立诺他对许多肿瘤具有较好的治疗效果[5-7]。然而伏立诺他对卵巢癌SKOV3的作用机制未见报道。

肿瘤细胞具有无限增殖能力，其抗肿瘤药物治疗的共同途径就是调控细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡，Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中具有重要的作用，一类是抗凋亡蛋白Bcl-2，另一种是凋亡蛋白Bax在肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用。细胞周期调控蛋白CyclinD1能够调控细胞周期，影响肿瘤细胞增殖情况，在抗肿瘤治疗过程中发挥着重要作用。p53基因为抑癌基因，存在于正常细胞核中，对细胞凋亡具有促进作用，对细胞损伤分化具有抑制作用，主要功能为检测基因组损伤、启动修复损伤机制、抑制或阻滞细胞转化、诱导损伤的细胞凋亡等，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[8-9]。在肿瘤组织中组蛋白去乙酰化酶存在过表达或者异常聚集，导致核小体组蛋白低乙酰化，染色质结构解聚和转录异常。研究发现组蛋白甲基化能够改变染色质重构，降低组蛋白复合体附近DNA的转录作用，赖氨酸残基发生不同水平的甲基化能够引起不同的活化状态，在赖氨酸甲基化中组蛋白H3第4位赖氨酸乙酰化(Histone-H3 lysine-4 acetylation，H3K4ac)和组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化(Histone-H3 lysine-27 acetylation，H3K27ac)尤其重要，与基因的转录活化和转录抑制有关[10]。研究发现，伏立诺他能够对肿瘤细胞周期阻滞，同时诱导变异细胞的凋亡[11]。因此，本研究以卵巢癌SKOV3为研究对象，探讨伏立诺他对SKOV3细胞增殖、周期的影响和p53的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

青霉素、链霉素、胰蛋白酶、1640培养液(Hyclone，美国)；TBD优级胎牛血清(灏洋生物，天津)；CCK-8试剂盒(Dojindo，日本)；逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒(天根，北京)；H3K4ac antibody和H3K27ac antibody(Abcam，UK)；光学显微镜(Olympus，日本)；酶标仪(TECAN，瑞士)；人卵巢癌SKOV3细胞购自上海中桥新舟。

1.2 细胞培养与分组

将人卵巢癌SKOV3细胞株置于5% CO2、37℃培养箱中孵育，待细胞长至80%～90%时，加入含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶1～2 mL，置于含5% CO2、37℃饱和湿度的CO2培养箱中1～3 min取出，在倒置显微镜下观察细胞形态，细胞变圆时加入含有10%胎牛血清的培养基终止消化，加入新鲜培养基，用滴管混合均匀，分装于不同的培养瓶中培养，采用对数生长期的细胞进行后续实验。细胞实验共分为四组，分别为空白组(Blank)、伏立诺他高剂量(VG)组(16 μmol/L)、伏立诺他中剂量(VZ)组(8 μmol/L)和伏立诺他低剂量(VD)组(4 μmol/L)。

1.3 CCK-8法检测伏立诺他对SKOV3细胞增殖影响

取对数生长期人卵巢癌SKOV3细胞，调整细胞密度为104/mL加入96孔培养板，每孔加入200 μL置于5% CO2、37℃培养箱中孵育，待细胞铺满后每孔加入浓度为4 μmol/L、8 μmol/L和16 μmol/L的伏立诺他200 μL，空白组加入同体积的基础培养液，每个浓度重复6个复孔，继续培养48 h，干预结束后每孔加入10 μL的CCK-8继续孵育4 h，酶标仪检测490 nm处的吸光度值。

1.4 Western blot检测SKOV3细胞H3K4ac和H3K27ac蛋白表达

将SKOV3细胞以5×105/mL密度接种在六孔板中，每孔加入2 mL的细胞悬液，置于5% CO2的培养箱中37℃培养。待细胞长满瓶底面积的80%以上时将相应的孔板分为四组即空白组、伏立诺他高剂量组(16 μmol/L)、中剂量组(8 μmol/L)和低剂量(4 μmol/L)，加入相应的药物，继续培养24 h，弃上清液每孔加入400 μL含有PMSF的Western及IP裂解液，运用细胞刮刀刮取细胞后收集到1.5 mL离心管中，冰浴匀浆使细胞充分裂解，12 000 r/min离心20 min，取上清液分装于离心管中，测定各组蛋白浓度，加入SDS-PAGE样蛋白缓冲液，进行高温变性，取等量的蛋白样本进行SDS-PAGE电泳，将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉室温孵育2 h后加入稀释后的一抗(H3K4ac，1∶1 000；H3K27ac，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000稀释)，在4℃的条件下孵育过夜，之后TBST室温漂洗5次，每次10 min，漂洗结束加入辣根酶标记二抗，室温孵育1 h，在进行漂洗5次，ECL显色，得到扫描条带，利用图像处理软件对蛋白条带进行分析。

1.5 卵巢癌SKOV3细胞中mRNA表达

1.5.1 SKOV3细胞总RNA提取 取对数生长期SKOV3细胞平铺于12孔培养板，待SKOV3细胞融合至80%时加入浓度为4 μmol/L、8 μmol/L和15 μmol/L伏立诺他，对照组加入同体积的培养液继续培养48 h后，弃上清液，PBS冲洗两次，收集不同组别的SKOV3细胞，加入1 mL的Trizol裂解液充分裂解，裂解后置于冰浴静置5 min，再加入预冷的0.2 mL的三氯甲烷，用力振荡后静置3 min，12 000 r/min，离心15 min，取上清液加入等体积预冷的异丙醇，静置10 min，12 000 r/min，离心10 min，弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇，洗掉沉淀中的异丙醇，10 000 r/min，离心10 min，弃上清，加入30 μL的DEPC水中，测定RNA浓度。

1.5.2 逆转录反应 取PCR专用管加入1 μL OligodT，RNA量由浓度经计算决定，以DEPC水补足至8 μL，离心机6 000 r/min，2 min离心，置入PCR仪，70℃金属浴10 min，取出后置于冰盒室温进行以下操作：即向体系依次加入下列成份：5×反转录酶Buffer 4 μL，dNTP(2.5 mM)4 μL，0.1 M DTT 2 μL，RNAse Inhabitor 1 μL，M-MLV 1 μL，置入PCR仪，95℃ 5 min→37℃ 1 h→4℃。

1.5.3 实时荧光定量PCR检测 此过程为20 μL体系，用GAPDH作为内参校正，Bcl-2上游引物：5′-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC 3′，下游引物：5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTC GAC-3′；Bax上游引物：5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游引物：5′-TCCCGGAGGAAGTCCATT-3′；CyclinD1上游引物：5′-GGATGCTGGAGGTCTGCG-3′，下游引物：5′-AGAGGCCACGAACATGCAAG-3′；GAPDH上游引物：5-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3，下游引物：5-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3。按照荧光定量试剂盒的说明书，在96孔板中依次加入：Maxima SYBR Green qPCR Master 10 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，Template DNA 1 μL，DEPC水 7 μL，每个样本均设置3个复孔，预变性，95℃ 5 min；变性，95℃，30 s；退火，60℃，30 s；延伸，72℃，30 s；重复变性、退火、延伸，共55个循环，充分延伸，72℃，10 min，结束温度为4℃。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 伏立诺他对SKOV3细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示不同浓度的伏立诺他能够对SKOV3细胞增殖产生抑制作用。与空白组比较，伏立诺他低、中、高剂量细胞增殖明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与低剂量伏立诺他比较，中、高剂量伏立诺他的细胞增殖明显降低，与中剂量伏立诺他比较，高剂量伏立诺他的细胞增殖明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。伏立诺他对SKOV3细胞的作用呈剂量依赖性增强(表1)。

表1 不同浓度伏立诺他对SKOV3细胞增殖作用影响Table 1 Effects of Vorinostat on the proliferation of SKOV3 cells

2.2 伏立诺他对SKOV3细胞蛋白表达影响

Western blot检测结果显示不同浓度的伏立诺他能够增加SKOV3细胞中H3K4ac和H3K27ac蛋白表达。与空白组比较，低、中、高剂量组的伏立诺他干预后SKOV3细胞H3K4ac和H3K27ac蛋白明显增加(P<0.05)，且随着伏立诺他剂量的增加作用增强(图1)。

图1 伏立诺他对SKOV3细胞H3K4ac和H3K27ac蛋白表达影响Figure 1 Effect of Vorinostat on the expression of H3K4ac and H3K27ac protein in SKOV3 cells

2.3 伏立诺他对SKOV3细胞mRNA表达影响

与空白组比较，伏立诺他低、中、高剂量组中抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA的表达明显降低，凋亡蛋白Bax mRNA的表达明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与空白组比较，伏立诺他低、中、高剂量组中细胞周期蛋白CyclinD1 mRNA表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与空白组比较，伏立诺他低、中、高剂量组中肿瘤抑制因子p53 mRNA表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 伏立诺他对SKOV3细胞mRNA表达的影响Table 2 Effect of Vorinostat on the expression of p53，Bax，Bcl-2 and Cyclin D1 mRNA in SKOV3 cells

3 讨论

肿瘤细胞处于一种细胞凋亡与增殖之间失衡的状态，肿瘤的发生与细胞凋亡有着密切的关系，细胞凋亡异常，进而导致肿瘤的发生。细胞凋亡是一个级联反应，包括信号启动、信号转导以及执行等多因素调控的过程。当前抗肿瘤药物的共同途径就是诱导肿瘤细胞凋亡，其中细胞凋亡有两个主要途径：外源性途径和内源性途径，即死亡受体途径和线粒体途径。大多数学者认为线粒体在细胞凋亡中处于中心地位，凋亡信号经线粒体放大，激活Caspase级联反应，进而激活凋亡蛋白的表达，诱导细胞进入凋亡程序[12]。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中具有重要的作用，研究发现Bcl-2家族蛋白存在两种不同的功能，一类是抗凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-xl，另一种则是凋亡蛋白如Bax促进凋亡的发生[13-15]。本研究发现与空白组比较，给予不同浓度的伏立诺他能够明显抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达，而凋亡基因Bax mRNA表达明显增加，表明伏立诺他能够促进卵巢癌SKOV3的凋亡。CyclinD1为细胞周期调控基因，对细胞周期具有调控作用。给予不同浓度的伏立诺他能够明显降低细胞周期蛋白CyclinD1 mRNA表达，表明伏立诺他对细胞周期具有阻滞作用。CCK-8检测结果发现与空白组比较，伏立诺他能够明显降低卵巢癌SKOV3吸光度值，表明伏立诺他能够抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖；伏立诺他高、中、低剂量组组间比较，具有统计学差异，表明伏立诺他对卵巢癌SKOV3细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。

目前研究证明表观遗传能够调控肿瘤的发生发展，其主要核心就是组蛋白共价修饰，组蛋白共价修饰广泛参与基因的转录沉默[16]。组蛋白乙酰化状态由组蛋白乙酰基转移酶和组蛋白去乙酰化酶共同决定的[17]。组蛋白去乙酰化可以引起抑癌基因p53的表达，p53被抑制或过度激活都可导致肿瘤的发生[18-19]。本研究Western blot结果发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他能够明显增加H3K4ac和H3K27ac蛋白的表达，表明伏立诺他能够明显抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，进而增加组蛋白乙酰化酶含量。RT-PCR结果发现给予不同浓度的伏立诺他后p53 mRNA表达明显增加，且随着剂量的增加作用增强。

综上所述，组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他能够抑制卵巢癌SKOV3的增殖和促进凋亡作用，其可能机制是增加H3K4ac和H3K27ac蛋白表达，激活抑癌基因p53的转录有关。