超高脱乙酰度壳聚糖制备与表征综合实验设计

陈 伟, 柏正武

(武汉工程大学 环境与化工清洁生产实验教学中心, 湖北 武汉 430073)

实验教学是培养学生实践能力、创新思维的重要环节。综合性实验教学改革与创新是实验教学研究的热点,也是构建和完善多层次实验教学体系有效途径[1]。将科研成果转化为综合实验教学内容,能激发大学生科研兴趣,提升科学研究和科技创新能力,促进教学科研融合,更有利于形成科研支持教学、教学科研协同发展的良好局面[2]。

甲壳素是自然界中含量丰富的氨基多糖,壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物。壳聚糖因具有无毒、生物可降解和生物相容性等特点,被广泛应用于水处理、药物载体、化妆品、食品以及制药等领域[3]。壳聚糖脱乙酰度(degree of deacetylation, D.D.)的高低和分子量的大小直接影响到壳聚糖及其衍生物的吸附特性[4-5]、抑菌性能[6]以及分离性能[7-8]。因此,不同分子量的超高脱乙酰度壳聚糖的制备具有重要的应用价值。

本课题组近年结合文献报道,通过多次实验,总结出一套成熟的制备超高脱乙酰度壳聚糖的方法,并合成了100多种手性识别能力强、稳定好的壳聚糖衍生物手性固定相[9]。本文基于课题组有关壳聚糖的研究成果,设计了超高脱乙酰度壳聚糖的制备与表征综合实验。本实验从天然甲壳素的预处理出发,包含壳聚糖降解与脱乙酰反应、核磁共振分析、红外光谱分析、高分子分子量的测定等内容,将壳聚糖制备、结构分析、分子量的测定和大型仪器的应用结合在一起。

1 实验原理

甲壳素通过降解得到超高脱乙酰度壳聚糖(脱乙酰度大于95%),其降解的方法主要有化学降解、物理降解和酶降解等,化学降解又包括H2O2氧化法、酸性或碱性水解法等[10]。将甲壳素在含NaBH4的NaOH/H2O体系中回流反应,干燥后再在正戊醇/NaOH体系中回流反应,就能制备出超高脱乙酰度的壳聚糖(见图1)。通过调整反应时间和温度可以得到不同分子量壳聚糖。如果部分壳聚糖因氧化而呈黄色,可用NaBH4还原,使之变成白色。用该方法制备的壳聚糖脱乙酰度可以达到98%以上,该方法实用、可靠,简单易行。

图1 壳聚糖的制备途径

2 实验

2.1 试剂与仪器

试剂：虾壳(工业级),购自潍坊市海纳甲壳素厂；氢氧化钠、硼氢化钠、戊醇、冰醋酸、氯化钠和溴化钾均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司；氘代三氟乙酸,美国剑桥CIL(同位素标准品)公司。

仪器：乌氏黏度计(毛细管直径0.5～0.6 mm)；低温恒温反应浴,巩义市英峪予华仪器厂；JYL-C012九阳料理机,九阳股份有限公司；金属丝编织网试验筛(φ200 mm×50 mm, 0.15 mm/0.1 mm),中国航空工业第五四零厂；FT-IR红外光谱仪,美国PerkinElmer公司；Agilent DD2 400 MHz核磁共振仪,美国安捷伦公司；Vario EL Ⅲ CHNOS型元素分析仪,德国Elementar公司。

2.2 实验流程

实验流程见图2。

图2 超高脱乙酰度壳聚糖的制备与表征流程

2.3 壳聚糖的制备

用蒸馏水将片状虾壳洗净并干燥,粉碎、过筛,收集筛网下的虾壳粉甲壳素作为原料。参考文献[11]方法,称取20.00 g干燥的甲壳素于500 mL的三口瓶中,按照甲壳素、NaBH4、NaOH、水质量比为10∶1∶81.82∶100分别加入163.64 g NaOH、2.00 g NaBH4、200.00 g蒸馏水中,升温至140 ℃,回流反应4 h；将反应液倒入装有蒸馏水的烧杯中搅拌后趁热过滤,洗至中性,干燥；产品再按相同的比例重复反应4 h,得到超高脱乙酰的壳聚糖；然后,将以上制备的壳聚糖按照壳聚糖、NaBH4、NaOH、正戊醇质量比为10∶1.1∶50∶110加入到500 mL的三口瓶中，在150 ℃回流6 h,将反应液倒入装有蒸馏水的烧杯中搅拌后趁热过滤,用水洗至中性,烘干得13.8 g 白色有珍珠光泽的片状固体,产率为69%。

2.4 壳聚糖脱乙酰度的测定

将15 mg壳聚糖完全溶解0.5 mL CF3COOD中,经核磁共振仪扫描得到谱图。根据谱图中不同化学环境的氢质子的积分面积,计算壳聚糖的脱乙酰度DD[12]。计算公式如下：

(1)

其中HAC表示甲壳素乙酰基上的甲基氢的峰面积,H1-6表示壳聚糖结构单元骨架上氢的峰面积。

2.5 壳聚糖黏均分子量的测定

将0.25 g壳聚糖溶解于0.1 mol/L CH3COOH与0.2 mol/L NaCl溶剂中,并用100 mL容量瓶定容,得到质量浓度为2.5 g/L的壳聚糖溶液；再用稀释法分别配制质量浓度为0.25、0.5、1.0、1.5 g/L的壳聚糖溶液。经砂芯漏斗过滤,用移液管移取10 mL滤液于乌式黏度计中,在25 ℃的水浴中恒温10 min以上[13]；用秒表分别测定5种壳聚糖溶液和溶剂在黏度计中的下落时间。根据Mark-Houwink方程计算壳聚糖的黏均分子量。

相对黏度ηr=t/t0(溶液流出时间/纯溶剂的流出时间),增比黏度ηsp=ηr-1。在无限稀释条件下,比浓黏度ηsp/c与lnηr/c的极限值都等于特性黏度[η],其中[η]=KMα,K=1.81×10-3,α=0.93[14]。

2.6 壳聚糖的红外光谱和元素分析

采用KBr压片法将样品制成薄片,用红外光谱仪扫描降解前后的壳聚糖,分辨率设为4 cm-1,扫描次数为16,分析降解壳聚糖的结构变化。甲壳素和壳聚糖中C、H和N用Elementar元素分析仪在CHN模式下测定。

3 结果与讨论

3.1 壳聚糖脱乙酰度的测定

壳聚糖的脱乙酰度是指脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中的糖残基数的百分数。壳聚糖脱乙酰度的测定方法主要有滴定法、核磁共振波谱法和色谱法等方法[15]。其中滴定法因装置简单、操作简便,常用于脱乙酰度的测定[16],但滴定法存在着样品用量较大、滴定操作不易控制、终点不易观察等缺点。核磁共振波谱法(NMR)准确度高且重现性好,是美国材料与试验协会认定的测定壳聚糖脱乙酰度标准方法[17],也是测定壳聚糖脱乙酰度最准确的方法之一。壳聚糖乙酰基上的甲基氢和结构单元骨架上氢的化学位移值不同,通过测试这两部分氢质子的积分面积就可以计算出壳聚糖的脱乙酰度。

图3为所制备的壳聚糖的1H NMR谱图(图上方数字为积分面积),δ=2.3×10-6处为壳聚糖中残留的乙酰基上的甲基氢,δ=(3.73～5.43)×10-6处为壳聚糖结构单元骨架上的氢,将其积分面积分别代入公式(1),计算出壳聚糖脱乙酰度为99.3%。

图3 壳聚糖的1H NMR谱图(TFA-D, 298 K, 400 MHz)

3.2 壳聚糖黏均分子量的测定

分子量的高低对壳聚糖性质和应用有较大影响[6],用光散射法和凝胶色谱法分别可以测定壳聚糖的重均分子量和数均分子量。因本实验只需得到相对的分子量，且这两种方法的实验设备较昂贵,故选择黏度法测定分子量。壳聚糖的特性黏度直接反映了壳聚糖的分子量大小,黏度就越大,其相对分子量越高。

根据壳聚糖溶液流出时间和纯溶剂的流出时间,计算相对黏度ηr和增比黏度ηsp,以比浓黏度ηsp/c对浓度c作图,得一条曲线,以lnηr/c对c作图得另一条曲线。将两条曲线拟合后外推至浓度c→0,得到特性黏度[η],如图4所示。由公式[η]=KMα(其中K=1.81×10-3,α=0.93)计算得壳聚糖黏均分子量为14.6万。

图4 特性黏度曲线

3.3 壳聚糖的红外表征和元素分析

图5为甲壳素与不同脱乙酰度的壳聚糖的傅里叶红外(FTIR)谱图。从图5中a可以看出,在1 655 cm-1以及1 622 cm-1处有非常明显吸收峰，为甲壳素的酰胺I带特征吸收峰,该双重峰分别是CO与相邻的分子链上N—H或O—H之间形成两种不同氢键形成的[18]；在1 560 cm-1左右吸收峰为酰胺Ⅱ带特征吸收峰,N—H弯曲变形吸收峰；在1 315 cm-1左右吸收峰为酰胺III带特征吸收峰,—C—N伸缩振动吸收峰。随着脱乙酰度的增加,酰胺I和III带的吸收峰逐渐消失,酰胺II带的吸收峰随着DD的提高从1 560 cm-1移向高波数至1 597 cm-1 [19]。当脱乙酰度为97.93%时的壳聚糖在1 654 cm-1处的峰强度明显减弱,1 595 cm-1处的N—H变得更加尖锐：当DD为99.88%的壳聚糖的羰基吸收峰已经消失,只有1 597 cm-1处的N—H峰,视为完全脱乙酰。

图5 甲壳素及壳聚糖的红外光谱图

FT-IR谱图既能反映高分子官能团结构特征,又能反映高分子的结晶性。壳聚糖结晶度的增加会使C—H伸缩振动峰向低频移动[18]。因此可以通过2 960～2 840 cm-1处的C—H伸缩振动吸收带的变化来判断壳聚糖结晶状态的变化。从图5可知,甲壳素的C—H伸缩振动峰为2 891 cm-1,而脱乙酰度97.93%和99.88%壳聚糖的C—H伸缩振动峰分别为2 884 cm-1和2 883 cm-1,C—H伸缩振动峰向低波数移动,表明制备的壳聚糖的结晶度有所升高。结晶度的提高虽然不利于壳聚糖进一步修饰反应,但高分子结构更加规整,有利于壳聚糖衍生物的分离性能和溶剂耐受性[9]。另外,甲壳素的1 075 cm-1处的振动吸收峰随着脱乙酰度增加,逐渐变宽,表明壳聚糖分子的β-糖苷键发生了部分断裂,壳聚糖分子量降低。

(C6H11NO4·0.25H2O)n元素分析结果:理论值,C含量为43.50%、H含量为7.00%、 N含量为8.46%; 实测值C含量为43.21, H含量为7.09, N含量为7.87,实测值和理论计算值误差较小。依据C、H、N等元素的组成来推断结构式,对样品的纯度要求很高,而壳聚糖在干燥时难以完全除去结晶水,在称量过程中也容易吸附水,因此在计算结果时,采用了校正的方法,将理论值增加了0.25%的H2O。

4 结语

本文所介绍的壳聚糖的制备与表征是将科研成果中较为成熟且难度适中的内容转化成学生可以实际操作的本科综合性实验,该实验包含天然虾壳的处理、粉碎、过筛、降解、脱乙酰等制备过程及红外光谱、核磁共振光谱、元素分析和分子量的测定等表征过程。本综合实验的实验条件简单、结果可靠,实验内容涉及有机化学、分析化学和高分子化学等学科的知识点,将科研与教学有机结合,强化了基础,拓宽了学生的知识面。

在组织本科生课外科研活动的过程中,围绕超高脱乙酰度的壳聚糖制备和表征,开展了一系列壳聚糖应用研究。申报并完成了与之相关的3项武汉工程大学生校长基金项目,完成了两届本科毕业论文。近3年,在该综合实验的实施和支撑下,应用化学专业的两位学生获得湖北省优秀学士学位论文,3位学生分别获湖北省第8～10届大学生化学(化工)学术创新成果报告会二等奖。