重金属对气孔保卫细胞功能和活性的影响

李莉娟,仪慧兰

(山西大学 生命科学学院,山西 太原 03006)

重金属离子是目前水体和土壤的主要污染物,一般无色无味且不能被生物降解,对环境的影响具有长期性和不可逆性,由此引发的人类饮食污染严重危害了人群健康。环境中高浓度金属离子会抑制植物生长发育,引发细胞生理和代谢紊乱,造成组织结构损伤,甚至植株死亡[1]。

重金属的危害涉及植物生理和结构的众多方面,如高浓度Cd2+、Pd2+离子可破坏叶绿体和线粒体结构,致叶绿素的合成量下降[2],Cd2+、Pd2+、Cr6+、Cu2+、Hg2+等影响光合作用与呼吸作用,抑制根部对营养元素和水分的吸收[3],引发植物细胞中微核、染色体断裂等遗传损伤效应[4],进而抑制植物生长,严重时引发死亡。铝虽然不属于重金属元素,但酸性土壤中溶出的高浓度铝离子,具有与重金属离子相似的植物毒性效应,可使植株矮小变黄,还能引起根冠细胞的凋亡[4-5]。

气孔是植物与外界环境物质交换的主要通道。气孔保卫细胞是一种高度分化细胞,可通过自身形状的改变来控制气孔大小,以调节植物的生理状态。气孔保卫细胞可对外界环境做出灵敏而准确的反应,现已成为一种研究外界环境对植物作用的模式系统[6-7],参与对环境污染物二氧化硫、铝、砷的响应[4,8-9]。因此,本文选用蚕豆气孔保卫细胞来研究Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+及电镀废水对细胞活性和功能的影响,为揭示重金属污染的毒害效应提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料准备

取蚕豆(ViciafabaL)种子,次氯酸钠消毒后,蒸馏水浸泡,湿纱布包裹催芽,萌发后播种于营养土中,至于培养间培养。培养条件:光/暗周期为14 h/10 h,温度22-25℃,光照强度300 μmol·m-2·s-1。幼苗生长至4周时用于实验。

从蚕豆幼苗上选取完全展开的叶片,镊子撕取其下表皮,切成0.20 cm2的小块,浸泡于MES缓冲液中。MES缓冲液含50 mmol/L KCl,10 mmol/L MES,0.1 mol/L tris-(hydroxymethyl) aminomethane(Tris),pH值为6.1。

1.2 重金属废水处理

以MES缓冲液为溶剂,用AlCl3、K2Cr2O7、CuSO4和HgCl2分别配制含有Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+的金属溶液,每种溶液设置4个浓度梯度(0.05 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L和5 mg/L),作为模拟废水。以太原市某电镀车间产生的电镀废水作为实际重金属废水,其中Cr6+34.88 mg/L、Cd2+0.89 mg/L、Pb2+1.79 mg/L、Ni2+3.56 mg/L、Zn2+2.98 mg/L、Fe2+3.46 mg/L、Cu2+3.26 mg/L,梯度稀释后用于毒性测试。

将缓冲液中的表皮条进行2 h的光照诱导,随后放入不同处理液中继续光照,2 h后检测气孔开度。选用外源活性氧(ROS)清除剂抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)或质膜钙离子通道抑制剂LaCl3,与重金属离子共同作用于蚕豆表皮,来分析金属离子影响气孔运动的机制。

1.3 气孔开度测量

药物处理后,表皮条用MES浸洗,铺展于载玻片上,光学显微镜观察、拍照,并利用DP2-BSW软件测量气孔开度[10]。每个实验组中的表皮条分别从3个不同植株上摘取,随机选取每个表皮条上的10个视野(40×)进行观察,测量气孔数量不得少于500个。每个实验处理重复3次。

1.4 细胞活性观测与统计

参照实验室之前建立的方法[11]对保卫细胞活性进行观测。表皮条用含金属离子的MES缓冲液孵育3 h,0.1 mg/mL 的Fluorescein diacetate(FDA)染色10 min,荧光显微镜观察。统计具有亮绿色的活细胞数和无荧光的死细胞数,计算细胞死亡率。

1.5 统计分析

计算3个重复实验的平均值作为各组的实验值,F检验后,用Duncan法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 模拟废水对气孔开度的影响

检测四种金属离子在0.05～5 mg/L范围内对蚕豆气孔开度的影响,发现金属离子处理组气孔开度明显小于对照组,气孔开度随金属离子浓度升高而减小(图1),即一定浓度的金属离子能影响气孔的运动功能。结合我国污水综合排放标准(GB8978-1996)中Cr6+、Cu2+含量的达标限值0.5 mg/L,及Hg2+的达标限值0.05 mg/L,可以看出,即使金属离子浓度低于国标限值,也能影响气孔运动。

Fig.1 Effects of Al3+, Cr6+, Cu2+ and Hg2+ on stomatal aperture of Vicia faba图1 Al3+、Cr6+、Cu2+和Hg2+对蚕豆气孔开度的影响

用0.05 mg/L的金属离子处理后,Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+处理组的气孔开度分别减小了4.63%、10.10%、11.82%和12.84%,其中Al3+对气孔开度的影响较小,表现较低的毒性效应,其余三种金属离子处理的气孔开度值接近,毒性相当。当金属离子浓度为5 mg/L时,气孔开度分别减小了27.78%、33.94%、44.55%和49.54%,其中Cu2+和Hg2+的毒性效应明显高于Al3+和Cr6+,即金属离子浓度提高时Cu2+和Hg2+的毒性增强效应高于Al3+和Cr6+。

2.2 模拟废水诱导气孔运动的机理

用外源抗氧化剂AsA或质膜钙离子通道抑制剂LaCl3与金属离子共同作用于表皮条后,气孔开度明显大于金属离子单独处理组。0.05 mg/L的Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+作用后气孔开度显著低于对照组,加入0.1 mmol/L的LaCl3或1 mmol/L的AsA可使气孔开度显著增大(图2)。说明用AsA降低保卫细胞内的ROS或者用LaCl3抑制胞外钙内流,能抑制金属离子暴露引发的气孔关闭,金属离子诱导的气孔关闭与保卫细胞内的Ca2+和ROS水平升高有关。金属离子胁迫诱发ROS生成,可激活质膜上的Ca2+通道,介导胞外Ca2+内流,促使胞内Ca2+水平升高,继而调控气孔的开放和关闭过程[12-14]。

注A,对照;B,金属离子单独处理;C,金属离子与LaCl3共同处理;D,金属离子与AsA共同处理。Fig.2 Effects of ascorbic acid and lanthanum chloride on stomatal closure of Vicia fabainduced by Al3+、Cr6+、Cu2+ and Hg2+图2 AsA和LaCl3对Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+致蚕豆气孔关闭的影响

2.3 模拟废水对细胞活性的影响

Al3+、Cr6+、Cu2+和Hg2+处理3 h可使保卫细胞活性明显改变(图3)。浓度0.05 mg/L的金属离子处理对保卫细胞活性无明显影响,浓度大于0.5 mg/L时,处理组细胞死亡率明显增高,细胞死亡率随离子浓度提高而增大。浓度为5 mg/L时,Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+处理组的细胞死亡率分别为16.51%、18.20%、25.5%和34.0%,其中Cu2+和Hg2+的致死效应高于Al3+和Cr6+。一些保卫细胞活性降低而非丧失活性,对环境刺激的应答能力降低,可表现为气孔运动功能的异常。

由于Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+处理使保卫细胞内ROS水平提高(图2),而ROS作为信号分子,可以通过Ca2+调节气孔开度,或介导保卫细胞死亡[15]。当金属离子浓度增高时,胞内ROS水平随之增高,ROS超过一定阈值后触发细胞死亡途径,使保卫细胞死亡。

Fig.3 Effects of Al3+, Cr6+, Cu2+ and Hg2+ on stomatal guard cell viability图3 Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+ 对气孔保卫细胞活性的影响

2.4 电镀废水对气孔开度和细胞活性的影响

电镀废水处理对气孔开度和保卫细胞活性具有明显影响(图4)。电镀废水1 000倍稀释后气孔开度与对照组接近,而原液处理组开度显著低于对照组。1 000倍稀释液对保卫细胞活性无明显影响,100倍稀释组细胞死亡率显著高于对照组,且随稀释倍数的减小,细胞死亡率上升。电镀废水原液可致细胞死亡率达15.03%。这些结果表明,含有多种金属离子的电镀废水对气孔功能和细胞活性具有显著影响。

Fig.4 Effects of electroplating wastewater on stomatal aperture and cell viability of Vicia faba图4 电镀废水对蚕豆气孔开度和细胞活性的影响

实验所用电镀废水含有Cr6+、Ni2+、Pb2+等金属离子,其中Cr6+含量最高,为24.10 mg/L。将Cr6+处理液与相同Cr6+浓度的电镀废水进行比较,发现Cr6+处理液对气孔开度和细胞活性的影响更大。可见,电镀废水中的金属离子间存在复杂交互作用,能通过某种拮抗效应使同浓度Cr6+对蚕豆保卫细胞的毒性降低。生活中重金属污染一般由多种金属离子组成,而不同金属离子共同作用则可能发生协同或拮抗效应[16],对植物体造成一定毒害作用。

3 讨论

土壤溶液和灌溉水中的重金属离子,可直接作用于植物根部,被根系捕获,或吸收、转运至地上部分,从而影响植物生理。重金属对植物的危害有多方面,可通过诱导ROS过量生成引起氧化应激[17],使胞内多种抗氧化酶系统功能紊乱,生物大分子氧化损伤,叶绿体结构受损,叶绿素及光合酶含量下降,光合作用抑制[18]。重金属还会影响土壤微生物活动,造成植物根系营养成分吸收受阻。总之,有害金属可破坏膜的功能和渗透性,使蛋白质和酶失活,并对光合作用和其他代谢过程产生有害影响。本文检测了几种金属离子对气孔保卫细胞的毒性,结果表明,Al3+、Cr6+、Cu2+、Hg2+四种金属离子,在低浓度下影响气孔开度,当浓度达到一定阈值则产生明显细胞毒性,使保卫细胞活性降低或丧失。

气孔是植物进行水分和气体交换的主要通道。本文中,金属离子暴露组因信号转导异常引发气孔运动异常,或因保卫细胞活性降低导致气孔运动异常,都将对植物生理造成不良影响。重金属离子暴露引发气孔关闭,会致植物水分蒸腾不足,进而抑制根部对水分的吸收,造成顶端水分缺失;叶面气孔开度缩小引发的气体交换不足,直接影响光合作用与呼吸速率,能抑制植物生长发育,甚至引起植株死亡[19-21]。

本结果中,气孔保卫细胞对水溶液中的金属离子敏感,可以检出达到国家污水综合排放标准限值以下的金属离子的存在。所检四种金属离子均能引发叶面气孔保卫细胞内活性氧水平升高,继而介导保卫细胞功能紊乱、甚至活性丧失,与前期在植物根尖细胞和其它组织中研究的结果[3-5]一致,符合当前关于金属离子毒性作用的理论。本文中采用的气孔保卫细胞系统,对单一金属离子响应的剂量效应以及对电镀废水梯度稀释的剂量响应,均说明了气孔保卫细胞系统对检测水溶液中金属离子毒性的有效性。之前我们还使用气孔保卫细胞检测了焦化废水的细胞毒性[10],实验结果与理化测试结果一致。

采用气孔保卫细胞系统,前人阐明了植物对逆境应答的信号途径[7,12,17],我们揭示了SO2[11,15]、亚砷酸钠[14]、电镀废水和金属离子的细胞毒性及其作用机制。这些结果体现了气孔保卫细胞系统在环境毒理学研究中的有效性及适用性。检测和评价重金属毒性可采用物理、化学以及生物手段,其中常用的生物检测技术有酶分析法、荧光偏振免疫分析、酶联免疫分析、生物化学传感器法等[22-23]。这些生物检测方法均需要专用设备,且检测重金属种类有限。本文通过实验证实气孔保卫细胞系统可用于对环境有害金属离子的检测,灵敏度高,可重复性强,且相比于其他生物监测系统该系统更为简便、经济。